表沒食子兒茶素沒食子酸酯穩(wěn)定性及穩(wěn)定化方法研究進(jìn)展

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表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是從綠茶中提取的一種兒茶素類單體，是綠茶主要的活性和水溶性成份，在兒茶素中含量最高，約占60%，占綠茶毛重的9%～13%[1-2]。大量研究表明，EGCG具有抗癌、抗炎、抗突變、抗衰老、改善肝功能、防紫外線、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防內(nèi)分泌紊亂和自身免疫疾病等多種生物活性[3]。并且，EGCG諸多藥理活性均與其強(qiáng)力的抗氧化活性有關(guān)[4]，其抗氧化活性是維生素E的20倍，超氧化物歧化酶的6倍[5]。EGCG的抗氧化活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)(具有8個(gè)酚羥基)密切相關(guān)(圖1)。在體外，EGCG的酚羥基易受光、氧、溫度、pH值等因素的影響氧化形成鄰醌，而鄰醌又很不穩(wěn)定，易發(fā)生復(fù)雜的聚合、縮合反應(yīng)，形成雙黃烷醇類、茶黃素類和茶紅素等，存在貯存、運(yùn)輸、加工過程中的降解問題[6-7]；在體內(nèi)，EGCG在腸胃中滯留時(shí)間短，吸收率不高，且易受體液影響而降解，生物利用度較低[8]。因此，EGCG結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定對(duì)維持其生物活性至關(guān)重要。目前，提高EGCG穩(wěn)定性的方法主要有2種，即采用化學(xué)方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和采用藥物制劑技術(shù)進(jìn)行劑型設(shè)計(jì)。作者重點(diǎn)綜述EGCG體內(nèi)外穩(wěn)定性及穩(wěn)定化方法，為保持EGCG活性及更廣泛的應(yīng)用提供新思路。

圖1 EGCG的結(jié)構(gòu)

1 EGCG穩(wěn)定性

1.1 EGCG體外穩(wěn)定性 EGCG結(jié)構(gòu)中有6個(gè)鄰位酚羥基(圖1)，在體外，隨著pH值的增加、溫度的升高、光照時(shí)間的延長等外界條件變化，易發(fā)生降解、異構(gòu)化及氧化等。眾多研究發(fā)現(xiàn)EGCG的體外轉(zhuǎn)化產(chǎn)物非常復(fù)雜，結(jié)構(gòu)難以確定。

許楠等[9]研究了EGCG在超聲場和非超聲場條件下，不同pH值對(duì)EGCG穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，EGCG在pH值6.0、6.2較穩(wěn)定，并且在超聲場條件下，EGCG的損失率均較非超聲場高。陳利燕等[10]將不同酸度的兒茶素溶液在25 ℃放置18 h后，兒茶素的含量都有所減少，而EGCG是8種兒茶素組分中最穩(wěn)定的。李邦玉等[11]采用紫外可見分光光度法定性研究溫度、時(shí)間、酸堿、紫外光、溶劑等對(duì)EGCG穩(wěn)定性的影響，以及EGCG分別與H2O2、DPPH·的反應(yīng)。研究結(jié)果表明溫度、時(shí)間、酸堿、紫外光等都不同程度影響EGCG的穩(wěn)定性，并且H2O2和DPPH·均可與EGCG反應(yīng)，破壞其結(jié)構(gòu)。吳平等[12]研究了不同溫度熱處理的EGCG，發(fā)現(xiàn)EGCG的氧化產(chǎn)物比較復(fù)雜，無法進(jìn)行定量分析。郭震等[13]考察了EGCG固體粉末的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示EGCG在強(qiáng)光、高溫、高濕條件下，EGCG粉末顏色有不同程度的變化，但含量均無明顯變化，也未見新的降解物質(zhì)產(chǎn)生，說明EGCG固體粉末的穩(wěn)定性較好。

1.2 EGCG體內(nèi)穩(wěn)定性 EGCG在胃腸滯留時(shí)間短、滲透性差、容易受胃腸環(huán)境(如pH值、酶等)的影響而變得不穩(wěn)定，從而使EGCG口服的生物利用度大大降低[14-16]。

EGCG在體內(nèi)的主要降解途徑有甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化。如連續(xù)注射3 d EGCG的小鼠血漿中發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物主要有單甲基EGCG、單硫酸甲基EGCG、單葡糖苷EGCG、單葡糖苷甲基EGCG等[17]。Kida等[18]在大鼠膽汁中發(fā)現(xiàn)了5種EGCG代謝產(chǎn)物，分別以硫酸化、葡萄糖醛酸化、硫酸化或硫酸鹽/葡萄糖醛酸結(jié)合物的形式存在。EGCG在過氧化物酶和過氧化氫酶作用下能夠與谷胱甘肽或半胱氨酸生成EGCG硫醇偶合物[19]。在人的血漿和尿液中發(fā)現(xiàn)EGCG主要甲基化產(chǎn)物，并且血漿中濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在尿液中的濃度，Meng等[20]認(rèn)為其原因可能是人腎中兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性較高的緣故。

2 EGCG穩(wěn)定化方法

2.1 用化學(xué)方法修飾EGCG EGCG因結(jié)構(gòu)中酚羥基較多，故脂溶性及穩(wěn)定性差，生物利用度低，使其深度應(yīng)用受到限制，而分子修飾能顯著的改善EGCG多種理化性質(zhì)。近年來，國內(nèi)外開展了EGCG改性的相關(guān)研究，以期改善EGCG的應(yīng)用特性。

1982年，日本科學(xué)家Saijo[21]首次從綠茶中分離出EGCG3″Me，隨后，在茶葉和茶樹體內(nèi)代謝物中不斷有甲基化的EGCG被發(fā)現(xiàn)，并且，這些甲基化產(chǎn)物的脂溶性、穩(wěn)定性方面均有所改善，并能保留其相應(yīng)的生物活性。在此啟發(fā)下，諸多科學(xué)家為了解決天然甲基化EGCG數(shù)量有限和獲取困難的問題，合成了一系列EGCG甲基化、?；?、糖苷化衍生物[22-23]。如，Miyase和Sano[24]將EGCG以及甲基供體CH3I溶于N，N-二甲基甲酰胺中，在Li2CO3催化下在EGCG4″-OH上引入甲基后得到3個(gè)甲基化EGCG衍生物。Meng等[20]將EGCG和CH3I加入丙酮溶液(或二甲基甲酰胺)中，以碳酸鉀作為催化劑，水浴超聲3 h后得到3種甲基化產(chǎn)物。呂海鵬等[25]以EGCG和CH3I作為原料，以丙酮作為溶劑，在碳酸鉀催化下合成了5個(gè)甲基化EGCG衍生物(圖2)。?；揎検侵冈贓GCG分子的8個(gè)酚羥基上選擇性地接上脂肪鏈而形成酯鍵的修飾方法。杜亞俊[22]合成了一系列EGCG酰化衍生物(圖3)，如全乙?；疎GCG、全丙?；疎GCG、全丁酰化EGCG等，實(shí)驗(yàn)證明，EGCG及其衍生物在人工模擬胃液中均能保持一定的穩(wěn)定性，且3種衍生物的穩(wěn)定性相比于EGCG明顯提高。糖苷化修飾是指在EGCG的8個(gè)酚羥基上選擇性地接上1個(gè)或多個(gè)親水性的單糖分子基團(tuán)(圖4)。如Kitao等[26]通過蔗糖磷酸化酶催化得到了2種EGCG糖苷化合物，分別是(-)-EGCG-4′-O-α-D-吡喃葡萄糖苷和(-)-EGCG-4′,4″-O-α-D-二吡喃葡萄糖苷。Moon等[27]從腸膜明串珠菌B-1299CB中提取蔗糖-6-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來催化蔗糖和EGCG反應(yīng)，在28 ℃下反應(yīng)6.5 h后將α-D-吡喃葡萄糖基引入C-4′位和C-7位，分離純化后得到3種產(chǎn)物。柳敏等[23]綜述了最近國內(nèi)外EGCG結(jié)構(gòu)修飾的常見方法，合成過程以及相應(yīng)的藥理活性研究，根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)不同，將EGCG修飾總結(jié)為3類，第一類是對(duì)EGCG的酚羥基進(jìn)行修飾，如對(duì)酚羥基進(jìn)行不同程度的甲基化修飾，?；揎棧擒栈揎梉28]；第二類是對(duì)EGCG的D環(huán)上的羥基進(jìn)行3-O-?；揎梉29]；第三類是對(duì)EGCG苯環(huán)上H原子的取代修飾，如C-6位和C-8位上取代修飾[30]。經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾獲得的EGCG衍生物在其穩(wěn)定性和生物活性等諸多方面都得到明顯改善。

圖2 甲基化EGCG的合成

圖3 ?；疎GCG的合成

圖4 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶制備糖苷化EGCG

2.2 采用制劑技術(shù) 隨著納米技術(shù)、分子包合技術(shù)、脂質(zhì)體技術(shù)、微乳技術(shù)等現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)的發(fā)展及新型載藥系統(tǒng)的出現(xiàn)，使得藥物在體內(nèi)具有可控性、緩釋性和靶向性等。同時(shí)，這些新技術(shù)也可用于包載藥物提高不穩(wěn)定藥物的穩(wěn)定性，從而提高其生物利用度。

2.2.1 制備成EGCG納米粒 納米微膠囊，其顆粒微小，易于分散和懸浮在水中，形成均一穩(wěn)定的膠體溶液，并且具有良好的靶向性和緩釋作用。通過將功能因子包裹于納米粒子內(nèi)部，能夠提高功能因子的穩(wěn)定性，促使其活性的最大發(fā)揮[15]。

侯紹云等[31]利用殼聚糖(chitosan，CS)和聚天冬氨酸(polyaspartic acid，PAA)之間離子交聯(lián)作用制備CS-PAA納米粒載體，裝載EGCG，制備的EGCG-CS-PAA納米粒，結(jié)果顯示納米體系對(duì)EGCG活性具有良好的保護(hù)作用，并且對(duì)EGCG在高溫和堿性條件下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也有一定的保護(hù)作用。Zeng等[32]利用CS和三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate，TPP)之間交聯(lián)作用制備了EGCG-CS-TPP納米粒，并將EGCG包裹于CS-TPP納米粒中，再用葉酸(folic acid，F(xiàn)A)和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)進(jìn)行修飾得到FA-NPS-PEG和FA-PEG-NPS。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種納米粒均增加了EGCG在MCF-7細(xì)胞中的穩(wěn)定性、增強(qiáng)了EGCG對(duì)MCF-7細(xì)胞的靶向性，并可明顯抑制MCF-7細(xì)胞的增殖分化。

2.2.2 制備成EGCG脂質(zhì)體及類脂質(zhì)體 脂質(zhì)體或類脂質(zhì)體可以在貯藏和胃腸道消化過程中保護(hù)活性物質(zhì)；控制被包埋物在體內(nèi)緩慢釋放；擁有低毒性、生物相適性以及生物可降解性等特點(diǎn)[33]。

2.2.3 其他制劑技術(shù)穩(wěn)定化方法 Onoue等[36]采用乳化溶劑揮發(fā)法制備了EGCG腸粘附微球，Eudragit?S100為腸粘附材料。結(jié)果顯示，該微球直徑為16 μm，在體外釋放具有pH值依賴性，避免了在胃中的突釋，并且能粘附于離體大鼠小腸中，明顯降低了EGCG的化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性。為改善EGCG的脂溶性，提高其生物利用度，陳金玉等[37]制備了EGCG磷脂復(fù)合物，結(jié)果顯示，EGCG磷脂復(fù)合物具有顯著的抗氧化活性，并且可以有效抑制大豆油的氧化。王榮鎮(zhèn)等[38]以肉豆蔻酸異丙酯為油相，吐溫-80和司盤-80復(fù)配表面活性劑(表面活性劑的親水親油平衡值為6)為表面活性劑，乙醇為助表面活性劑制備了油包水型的EGCG抗氧化微乳液，并對(duì)其穩(wěn)定性和抗氧化活性進(jìn)行考察。微乳液外觀澄清透明，改善了EGCG脂溶性差的缺點(diǎn)，并且在植物油中表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。

3 總結(jié)與展望

EGCG的化學(xué)結(jié)構(gòu)(具有8個(gè)酚羥基)決定其具有超強(qiáng)的抗氧化活性，從而表現(xiàn)出廣泛的藥理作用。但EGCG特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)也導(dǎo)致其在體內(nèi)外的不穩(wěn)定性，影響生物利用度，限制其成藥性。目前，提高EGCG穩(wěn)定性的方法主要集中在化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾和劑型改造兩個(gè)方面。經(jīng)過化學(xué)修飾的EGCG結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，脂溶性和穩(wěn)定性都有所提高，使EGCG在食品、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但是，不少修飾后的EGCG衍生物由于羥基數(shù)目的減少，其生物活性有所降低，并且毒副作用會(huì)隨之發(fā)生改變，需要系統(tǒng)研究候選化合物生物活性和毒副作用，工作量大。而采用現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)進(jìn)行劑型改造，不僅不改變藥物的結(jié)構(gòu)，可以完整地保留EGCG的8個(gè)活性酚羥基，改善其理化性質(zhì)的同時(shí)又不會(huì)帶來活性的損失，而且會(huì)提高藥物的穩(wěn)定性、緩釋性和靶向性。所以，新的劑型和載體可能是提高EGCG穩(wěn)定性的突破口。隨著新技術(shù)新劑型的發(fā)現(xiàn)，EGCG的不穩(wěn)定性將被克服，并最終應(yīng)用臨床。