外泌體研究、轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用專家共識

細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由細胞分泌的具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的囊泡，能夠通過其攜帶的生物大分子，調(diào)節(jié)受體細胞的生物學特性，參與細胞的生理學和病理生理學過程[1-2]。外泌體是EVs一個重要的亞群[1]，通常被認為是經(jīng)由多泡體與細胞膜融合而釋放到細胞外的，直徑為40～100nm的膜性囊泡狀小體[3]。檢測外泌體標志物，能夠?qū)崟r動態(tài)地反映患者的疾病狀態(tài)[4-7]，因此在疾病的早期篩查、無創(chuàng)診斷、療效監(jiān)控、輔助用藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。此外，其作為藥物載體的潛在形式，在腫瘤等疾病的治療中也展現(xiàn)出誘人的潛力[8-10]。

近年來與外泌體相關(guān)的研究呈井噴式發(fā)展，以國際細胞外囊泡協(xié)會(International Society for Extracellular Vesicles，ISEV)為代表的學術(shù)團體通過廣泛合作與探討，針對研究領(lǐng)域中的一些關(guān)鍵性問題撰寫了意見書[11-12]。雖然我國科研工作者在外泌體研究領(lǐng)域也作出了重要貢獻，但迄今為止國內(nèi)還沒有就外泌體研究形成共識或指南。參考基因測序等技術(shù)的發(fā)展歷程，我們不難發(fā)現(xiàn)新的診斷技術(shù)在疾病的診斷、治療以及預防方面提供有力支持的同時，也曾因為缺乏統(tǒng)一的標準及規(guī)范化流程而走了一些彎路。為響應(yīng)發(fā)改委及有關(guān)單位在《“十三五”生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃》中提出以服務(wù)民生需求為根本，加速生物產(chǎn)業(yè)在各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的指導思想，中國抗癌協(xié)會腫瘤標志專業(yè)委員會外泌體技術(shù)專家委員會組織專家撰寫了本共識。旨在促進國內(nèi)外泌體特別是外泌體腫瘤標志物的產(chǎn)學研結(jié)合，推動相關(guān)標準與規(guī)范的建立，理性引導技術(shù)轉(zhuǎn)化，并服務(wù)于民生。

1 外泌體經(jīng)歷了“從無到有，由冷到熱”的發(fā)展歷程

共識專家回顧外泌體研究的發(fā)展歷史。關(guān)于外泌體的報道可追溯到1985年，最早被認為是細胞的“排泄物”并沒有引起重視[13]。直到最近幾年，人們發(fā)現(xiàn)這種微小膜泡中含有細胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，能作為信號分子傳遞給其他細胞從而改變受體細胞的功能，才開始逐漸受到大家的關(guān)注。隨著里程碑式的研究成果不斷涌現(xiàn)，包括外泌體在內(nèi)的EVs的研究已進入了一個新的高潮。

(1)1985年，Johnstone研究組首次在體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清中發(fā)現(xiàn)了一種有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，并在1987年的論文中將其命名為Exosome。

(2)1996年，Raposo發(fā)現(xiàn)類似于B淋巴細胞能分泌抗原提呈外泌體，能攜帶MHC-Ⅱ類分子、共刺激分子和粘附分子。

(3)1999年，Théry等發(fā)現(xiàn)樹突細胞也可以產(chǎn)生有抗原提呈能力的外泌體。

(4)2007年，Valadi等發(fā)現(xiàn)細胞之間可以通過外泌體中的RNA交換遺傳物質(zhì)，這意味著細胞可以通過外泌體影響另外一個細胞。

(5)2013年，Rothman、Schekman和Südhof 3位科學家獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，以表彰他們在細胞內(nèi)部囊泡運輸調(diào)控機制方面做出的貢獻。

(6)2015年6月，美國M.D.Anderson Cancer Center的研究者發(fā)現(xiàn)早期胰腺癌患者血清中外泌體的GPC1(glypican-1)豐度顯著高于正常人群。

(7)2016年1月，Exosome Diagnostics公司推出世界首款外泌體癌癥診斷產(chǎn)品ExoDx Lung(ALK)。

(8)2016年5月，牛津大學開發(fā)出名為EvOx的外泌體治療產(chǎn)品。

(9)2017年，Kamerkar等采用外泌體作為載體遞送RNAi，靶向治療胰腺癌。

不難發(fā)現(xiàn)，外泌體研究之所以能迅猛發(fā)展，一方面得益于本身具有重要的生物學功能，另一方面分析和檢測技術(shù)的持續(xù)進步也為之奠定了良好基礎(chǔ)。盡管捷報頻傳，但目前對外泌體的了解依舊有限。共識專家認為現(xiàn)有的一些基于單中心、小樣本量的研究結(jié)果包括上述里程碑中提到的工作，還需進一步的研究和多中心臨床試驗予以驗證。雖然外泌體研究還存在諸多尚未解決的難題，共識專家堅信，這也正是值得研究與探索的魅力所在，隨著相關(guān)知識的逐步積累，外泌體一定有更豐富的奧秘等待我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。

2 外泌體分離方法豐富多樣，但缺乏標準

EVs一詞是ISEV創(chuàng)造的術(shù)語，是細胞釋放的囊泡的統(tǒng)稱[11]。EVs有不同的亞群，除外泌體之外，還有質(zhì)膜來源的囊泡，名稱包括微囊泡、脫落囊泡、外膜囊泡、癌小體以及凋亡小體等。這些EVs亞群在粒徑范圍、內(nèi)含物類型，以及生物學功能上，存在不同程度的重疊與區(qū)分。分離和提取外泌體的方法很多，但都是基于外泌體的某一種或若干種的理化性質(zhì)來實現(xiàn)的[14-15]，包括以下方法[16-23]。

2.1 超速離心法 依據(jù)密度特性，通過超高速離心將外泌體從生物流體中分離出來的方法。若結(jié)合蔗糖墊使用，能夠讓外泌體富集在密度1.13～1.19 g/mL的餾分中，從而提高產(chǎn)物純度。

2.2 超濾法 根據(jù)特定截留分子量的超濾膜，將粒徑較大的外泌體從生物流體中分離出來的方法。

2.3 排阻色譜法 當生物流體通過排阻色譜柱時不同分子量的顆?；蚍肿訒蛄魉俨煌环峙涞讲煌s分中，可用于外泌體的純化。

2.4 免疫磁珠法 通過將涂覆有抗標記抗體(如CD63、CD81和CD9)的磁珠與外泌體結(jié)合，可以選擇性分離外泌體。

2.5 聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇能夠在水溶液中形成網(wǎng)狀聚合物結(jié)構(gòu)并通過“劫持”水分子的方式改變外泌體溶解度，在較低的離心力下與外泌體共沉淀。

2.6 微流控芯片技術(shù) 利用微流控芯片技術(shù)可以將外泌體的分離、回收、檢測等多種操作整合至微米級別的芯片上進行。

2.7 其他分離方法 除上述方法外，還有利用細胞膜親和性、靜電作用、不同水溶性聚合物或有機溶劑對外泌體進行提取的方法，在此不一一贅述。

共識專家認為上述的所有分離方法，都存在各自的局限性。到目前為止，外泌體的分離方法還尚無公認的“金標準”。無論那種方法都不能將外泌體與其他EVs亞群徹底分離?？紤]到分離方法還沒有標準化，為確定研究工作中所描述的內(nèi)含物分子或生物學功能的確來自于EVs而非其他雜質(zhì)，ISEV提出了最小化實驗要求(MISEV2014)，建議對EVs進行必要的鑒定表征和功能學實驗。但我們也認識到這套方法對于非EVs雜質(zhì)的鑒定并不充分。設(shè)計實驗對產(chǎn)物中非EVs雜質(zhì)含量進行表征，又或者設(shè)法耗盡非EVs雜質(zhì)及其生物學活性，可能有助于提高研究結(jié)果的可靠性。

共識專家認為雖然目前還無所謂的“金標準”，但未來出現(xiàn)更好的EVs分離技術(shù)是大概率事件。而且，隨著我們對EVs認識的不斷深入，問題也可能以另外的途徑得到解決。例如，有人提議使用sEV(即small extracellular vesicle)這樣的表述來定義直徑小于200 nm的囊泡。雖然看似缺乏生物學意義，實質(zhì)更具可操作性。共識專家對此持開放態(tài)度，實踐是最好的檢驗標準。對于希望開展外泌體研究的科研工作者，建議根據(jù)樣本類型和下游的科學問題來選擇提取方法。

3 外泌體分析方法需要“量體裁衣”

3.1 外泌體形貌分析 使用透射電子顯微鏡或原子力顯微鏡，能夠?qū)蝹€EV的形貌和粒徑進行表征。

3.2 外泌體群體的粒徑分析 納米粒子示蹤分析技術(shù)、動態(tài)光散射，或電阻脈沖傳感，能夠統(tǒng)計大量外泌體的粒徑分布情況。

3.3 外泌體蛋白質(zhì)分析 蛋白質(zhì)印跡、流式細胞儀、ELISA或質(zhì)譜技術(shù)可用于分析外泌體(EVs)所攜帶的蛋白標志物。

3.4 RNA分析 二代測序可以了解外泌體中的RNA組成，對于已知的RNA可以通過qPCR或Northern印跡進行驗證。測序可能因為拼接偏倚，導致轉(zhuǎn)錄表達錯誤。微陣列技術(shù)可用于RNA含量的表達譜分析，但不能用于發(fā)現(xiàn)新序列。

3.5 DNA分析 與RNA分析相似，PCR、微陣列技術(shù)可以用于分析已知的DNA分子，二代測序可以用于新序列的發(fā)現(xiàn)。

3.6 代謝分析 外泌體代謝物包括脂質(zhì)、糖、氨基酸等小分子，代謝物的變化可以反映來源細胞的生化狀態(tài)。

一方面，外泌體因其尺度特點，對原有的分析技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。例如，傳統(tǒng)流式細胞儀無法測量粒徑<300 nm的顆粒，然而結(jié)合了瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測技術(shù)的超高靈敏流式檢測系統(tǒng)可以對粒徑低至40 nm的EVs的進行快速表征[24]。

另一方面，分析外泌體標志物豐度普遍偏低。例如，即使是外泌體中含量較高的microRNA平均每個外泌體內(nèi)還不足一個拷貝[25]。類似的，為了解決外泌體中蛋白質(zhì)定量的技術(shù)挑戰(zhàn)，新一代的蛋白分析方法正在開發(fā)中，如小顆粒流式細胞儀、微核磁共振、納米等離子體外體傳感器等。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，這些方法所需樣本量更少，并且操作簡單。

種植抗病品種是最經(jīng)濟有效的防治方法，目前尚無玉米瘤黑粉病免疫品種，但自交系和雜交種之間抗病性有明顯差異。利用抗黑粉病自交系材料，配制雜交種用于生產(chǎn)。

由此可見，根據(jù)外泌體的特性“量身定制”分析方法和檢測手段，未來會成為常態(tài)。雖然外泌體有著豐富的內(nèi)含物，但針對外泌體RNA的報道要多于其他內(nèi)含物，這一定程度上是檢測技術(shù)發(fā)展不均衡所導致的結(jié)果。隨著技術(shù)的不斷進步，分析方法的選擇勢必會擁有更廣泛的空間。于此同時，多學科的交叉，如基于人工智能的多組學算法開發(fā)，有望改變傳統(tǒng)單一標志物的概念，以組學的、圖譜式的方式對標志物進行重新定義。共識專家認為實現(xiàn)這一目的，離不開多學科人才的積極參與跟配合。

4 外泌體——液體活檢的“第三駕馬車”

共識專家中許多位既往有或目前從事其他液態(tài)活檢技術(shù)如循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)和循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)的經(jīng)歷。我們欣喜的看到在過去短短數(shù)年中，液體活檢技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)向臨床展示了其巨大的便捷性和信息豐度。由于能夠攜帶了母細胞來源的蛋白質(zhì)、RNA和DNA，外泌體提供了一種可以實時動態(tài)監(jiān)測疾病狀態(tài)的新方式，成為繼ctDNA和CTC之后液體活檢領(lǐng)域的“第三駕馬車”[26-27]。

共識專家認為在3大液體活檢技術(shù)之中，CTC是從實體腫瘤脫落并侵入外周血循環(huán)的腫瘤細胞，不僅攜帶了腫瘤的全部分子特征，還有細胞形態(tài)學信息；ctDNA是血液中腫瘤來源的DNA片段，直接來源于實體腫瘤或CTC；外泌體論尺度和所攜帶的信息量均介于二者之間。多數(shù)專家認為3種技術(shù)雖各有所長(表1)，但總體而言，外泌體至少在2個方面更具優(yōu)勢：①樣本形式更豐富。CTC和ctDNA主要來自于外周血，而幾乎所有體液樣本都含有外泌體，外泌體幾乎“無處不在”；②內(nèi)含物更穩(wěn)定，得益于磷脂雙分子層的保護，外泌體內(nèi)含物具有較好的穩(wěn)定性，雖然CTC也有細胞膜，但是進入外周血后只有極少數(shù)能夠抵達遠端，多數(shù)CTC的命運是失巢凋亡或被吞噬。

表1 現(xiàn)有液體活檢技術(shù)特點及對比

共識專家反復提到外泌體和腫瘤異質(zhì)性的關(guān)系。作為惡性腫瘤的一個特征，腫瘤異質(zhì)性是目前腫瘤診斷和治療的最大挑戰(zhàn)之一。深入研究腫瘤異質(zhì)性，可以更好地闡釋腫瘤發(fā)生、發(fā)展的原因，并可能指導人們制定更精細的治療策略。然而，腫瘤異質(zhì)性既體現(xiàn)在空間上也體現(xiàn)在時間上。受采樣區(qū)域和采樣時間的限制，傳統(tǒng)的組織活檢難以對腫瘤的異質(zhì)性進行實時動態(tài)的反映。液體活檢在很大程度上避免了這兩點限制，能夠涵蓋更廣泛的腫瘤亞群，并且可以多時間點采樣對腫瘤異質(zhì)性進行動態(tài)跟蹤。由于ctDNA只能反映基因組信息，無法全面反映轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組以及細胞形態(tài)學上的異質(zhì)性。CTC雖然攜帶了最為豐富的信息，但是因其豐度太低(0～102/mL)，需要獲得多少數(shù)量的CTC才足夠反映整個腫瘤的異質(zhì)性，尚且無明確的結(jié)論。相比之下，來源于幾乎所有腫瘤細胞，且豐度較CTC更高的外泌體給人們帶來了希望。隨著分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展和完善，外泌體是否能夠更好更全面的反映腫瘤的異質(zhì)性成為共識專家共同關(guān)心的議題。專家期待通過后續(xù)研究能夠得出更詳實的答案。

目前，雖然CTC、ctDNA和外泌體3大液體活檢技術(shù)在國際上均有診斷產(chǎn)品問世，但缺乏統(tǒng)一的標準似乎是液體活檢領(lǐng)域目前共通的問題，希望在多學科的共同努力之下，能夠盡快突破相應(yīng)的技術(shù)瓶頸，以達成統(tǒng)一的標準規(guī)范，將使得上述3種技術(shù)的臨床和應(yīng)用價值得以實質(zhì)性的體現(xiàn)。

5 外泌體標準化之路——道阻且長

在外泌體研究中，不可避免地會存在來自其他EVs亞群的干擾。此外，生物流體中還存在包括蛋白復合物(AGO2)、脂蛋白(高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和乳糜微滴)以及微生物等可能對后續(xù)實驗構(gòu)成影響的干擾物[28]。樣本采集和保存過程中的諸多因素，也可能對外泌體構(gòu)成未知的影響。共識專家認為目前缺乏標準化的提取和分析技術(shù)，外泌體標志物豐度低等一系列問題，為外泌體研究的標準化之路構(gòu)成了重重障礙。

古語有云“道阻且長，行則將至”。多學科的交叉和相互促進勢必為EVs及外泌體的研究和應(yīng)用帶來廣闊的前景，包括物理、化學、傳感以及工程學領(lǐng)域的技術(shù)進展，將有助于對外泌體的功能和化學計量進行更精確的分析，甚至在單囊泡水平對其組份進行鑒定及表征。人造EVs標準品的研制等工作，將有利于EVs及其內(nèi)含物回收效率的標準化校驗，并促進獨立驗證結(jié)果。隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是對外泌體的理化特性、生物學功能的理解進一步加深，多學科的共同關(guān)注和研究投入，未來必定會有更好的外泌體分離、分析技術(shù)不斷涌現(xiàn)。面對這些標準化問題，各研究團隊應(yīng)當主動出擊，匯聚多方力量共同尋求突破口。

6 展望

隨著個體化和精準醫(yī)療概念的提出，越來越多的研究者開始關(guān)注如何做到疾病的精準診斷及治療。外泌體作為一個新的研究熱點，由于它在體內(nèi)分布的廣泛性和獲取的便捷性，已經(jīng)成為疾病診斷治療的潛在有效方式，在精準治療上有著光明的前景。未來外泌體標志物不僅能夠用于疾病診斷、指導個性化治療，還可能用于疫苗開發(fā)與免疫治療、基因治療、靶向藥物治療等，為人類最終攻克癌癥等醫(yī)學難題帶來新的希望。

外泌體技術(shù)在臨床應(yīng)用研究仍然處于初級階段，其面臨的諸多挑戰(zhàn)也伴隨著誕生無數(shù)新發(fā)現(xiàn)和新技術(shù)的可能性。在重大疾病如惡性腫瘤中的功能研究及診療應(yīng)用已經(jīng)呈現(xiàn)其巨大的潛力及可能性，新興的領(lǐng)域中，新的認知和共識將不斷出現(xiàn)甚至顛覆。雖然其標準化的產(chǎn)生，可能是一個漫長和反復的過程，但如同礦藏一般，深挖一尺，便有一尺的驚喜。

專家組組長：張 灝

執(zhí)筆者：張 灝，趙立波，葉國棟

專家組單位和成員(按照單位和姓氏拼音排序)

澳大利亞新南威爾士大學(李 勇)

北京恩澤康泰生物科技有限公司(趙立波)

大連醫(yī)科大學(劉婷姣)

廣州金域醫(yī)學檢驗集團股份有限公司(李曉華)

國家納米科學中心(孫佳姝)

哈爾濱醫(yī)科大學(黃小義)

荷蘭格羅寧根大學(林宇晟)

暨南大學(董宏梅，王 通，葉國棟，張冬梅，張 灝)

南方醫(yī)科大學(李 欣)

上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司(張慶華)

上海中科新生命生物科技有限公司(寧嬋娟)

深圳大學(李曉武)

四川大學(賈 大)

廈門大學(蔡望宇，顏曉梅)

浙江大學(張 龍)

中國醫(yī)科大學(曲秀娟)

中山大學(李 疆，李孟鴻，宋立兵)