黑林1號(hào)楊抗病蟲(chóng)害基因研究

任立，馬金龍

摘要：黑林1號(hào)楊是一種人工雜交楊樹(shù)品種，以小黑楊為母體，波蘭15A為父體。黑林1號(hào)楊根系較發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)速度快，且抗旱抗寒性能強(qiáng)，適應(yīng)性強(qiáng)，是目前東北區(qū)域廣泛推廣和種植的楊樹(shù)品種。黑林1號(hào)楊在生長(zhǎng)過(guò)程中受病蟲(chóng)害的影響給其生長(zhǎng)和園林綠化、生態(tài)環(huán)境等造成巨大損失。本文主要對(duì)黑林1號(hào)楊的病蟲(chóng)害基因進(jìn)行研究，將外源抗病蟲(chóng)害基因?qū)肓值?，以培育出新的黑?號(hào)楊品種，以便更好地防治病蟲(chóng)害對(duì)其生長(zhǎng)過(guò)程的侵害，提高黑林1號(hào)楊的生長(zhǎng)發(fā)育質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：黑林1號(hào)楊；病蟲(chóng)害；基因研究

中圖分類號(hào)： S792 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.24.073

楊樹(shù)在我國(guó)種植面積大，用途廣泛，在經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著重要作用。隨著科技發(fā)展黑林1號(hào)楊雜交楊樹(shù)品種誕生，依靠其耐寒耐旱性能廣泛種植于北方區(qū)域。黑林1號(hào)楊因生長(zhǎng)速度快、周期短，容易繁殖，成為我國(guó)人工造林面積最大的楊樹(shù)品種之一，但是黑林1號(hào)楊在生長(zhǎng)過(guò)程中容易受病蟲(chóng)害的侵害，對(duì)其生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生不利影響。研究黑林1號(hào)楊的抗病蟲(chóng)害基因是本文的重點(diǎn)。

1 黑林1號(hào)楊抗病蟲(chóng)害基因現(xiàn)狀

黑林1號(hào)楊主要抗病蟲(chóng)害基因有Bt基因、植物凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因。其中Bt基因主要是從蘇云金芽孢桿菌中分離出來(lái)，在抵抗蟲(chóng)害時(shí)可以形成高濃度的危蟲(chóng)活性晶體蛋白。昆蟲(chóng)在食用了這種Bt基因后可腸內(nèi)轉(zhuǎn)化為毒性多肽分子，使昆蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生紊亂，引起昆蟲(chóng)細(xì)胞腫脹和裂解，從而影響昆蟲(chóng)的繁殖、生長(zhǎng)和發(fā)育。Bt基因是長(zhǎng)期以來(lái)廣泛應(yīng)用于黑林1號(hào)楊的抗病蟲(chóng)害藥物，效果理想。植物凝集素基因是1888年第一次發(fā)現(xiàn)的，屬于一種高度異質(zhì)性的特異糖結(jié)合活性蛋白，可廣泛存于植物的不同器官。與Bt的抗病蟲(chóng)害作用不同，它與Bt形成互補(bǔ)，主要抵抗刺吸式口器害蟲(chóng)的侵害。而蛋白酶抑制劑基因存在于大多數(shù)生物體內(nèi)，特別是植物種子或莖塊中，它可以使害蟲(chóng)消化不良，在減少害蟲(chóng)繁殖代數(shù)的基礎(chǔ)上降低害蟲(chóng)的數(shù)量。

2 黑林1號(hào)楊抗病蟲(chóng)害基因研究

黑林1號(hào)楊在生長(zhǎng)過(guò)程中受病蟲(chóng)害影響嚴(yán)重，會(huì)給其發(fā)育及生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害，如果黑林1號(hào)楊在生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常使用農(nóng)藥進(jìn)行病蟲(chóng)害的防治，會(huì)使病蟲(chóng)害產(chǎn)生抗藥性并發(fā)生變異，同時(shí)也會(huì)對(duì)林地產(chǎn)生不良影響。根據(jù)生態(tài)環(huán)境保護(hù)需求限制化學(xué)用農(nóng)藥的使用，通過(guò)轉(zhuǎn)基因品種的培育來(lái)有效控制病蟲(chóng)害對(duì)黑林1號(hào)楊的生長(zhǎng)影響?；蜣D(zhuǎn)化品種的研究可以使黑林1號(hào)楊的種植面積增大，同時(shí)可以控制不同種類的病蟲(chóng)害，在節(jié)約人力和財(cái)力的同時(shí)減少了環(huán)境的污染，有效促進(jìn)了林業(yè)的健康發(fā)展。

2.1根癌農(nóng)桿菌

根癌農(nóng)桿菌在進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)需要著重考慮影響因子之間的作用，本文只研究改變一個(gè)影響因子后黑林1號(hào)楊的葉片轉(zhuǎn)化率。預(yù)培養(yǎng)對(duì)黑林1號(hào)楊的遺傳轉(zhuǎn)化影響非常大，可以減少黑林1號(hào)楊在栽培過(guò)程中的外部污染，如果幼苗在預(yù)培養(yǎng)時(shí)有污染源，將會(huì)被淘汰。同時(shí)預(yù)培養(yǎng)也能使幼苗與培養(yǎng)基平整接觸，使黑林1號(hào)楊迅速吸收營(yíng)養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)。隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的增加，黑林1號(hào)楊葉片的分化率也在增加，如果黑林1號(hào)楊植株有傷口，則不能立即接受農(nóng)桿菌的侵染，因?yàn)檗r(nóng)桿菌產(chǎn)生的毒素會(huì)導(dǎo)致黑林1號(hào)楊死亡，但是經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)后，黑林1號(hào)楊的抵抗能力增強(qiáng)，傷口會(huì)慢慢愈合。預(yù)培養(yǎng)的菌液濃度和培養(yǎng)時(shí)間也影響遺傳轉(zhuǎn)化率，適宜的培養(yǎng)濃度和時(shí)間可以減少農(nóng)桿菌對(duì)黑林1號(hào)楊的毒害，提高黑林1號(hào)楊的轉(zhuǎn)化率。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)增加幼苗的生長(zhǎng)速度，使脫菌困難，植株由于缺氧導(dǎo)致死亡，從而降低轉(zhuǎn)化率。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短會(huì)使幼苗傷口不能正常附著農(nóng)桿菌，降低轉(zhuǎn)化率。黑林1號(hào)楊外植體與農(nóng)桿菌的共同培養(yǎng)是遺傳轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵，兩者共同培養(yǎng)可以幫助黑林1號(hào)楊細(xì)胞進(jìn)行正常分裂，促進(jìn)農(nóng)桿菌對(duì)黑林1號(hào)楊的侵染與轉(zhuǎn)化。共同培養(yǎng)的時(shí)間要長(zhǎng)于16天但又不能過(guò)長(zhǎng)，以避免共同培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致農(nóng)桿菌在黑林1號(hào)楊表面大量繁殖，影響轉(zhuǎn)化率。共同培養(yǎng)后需要將葉片轉(zhuǎn)入到脫菌培養(yǎng)基中，以減少假陽(yáng)性抗性苗的出現(xiàn)比例，并用帶有卡那霉素標(biāo)記作為基因標(biāo)記，使其進(jìn)入到黑林1號(hào)楊的細(xì)胞中。

2.2 抗性植株的分子生物學(xué)檢測(cè)

在進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)需要PCR檢測(cè)以獲得抗性芽，使外源基因達(dá)到最理想的生長(zhǎng)狀態(tài)。外源基因在黑林1號(hào)楊染色體上進(jìn)行整合的最可靠的方法是雜交，在雜交過(guò)程中可進(jìn)行轉(zhuǎn)化的特異性會(huì)形成雜交帶，可以確定選擇。雜交成功后可以將DNA進(jìn)行稀釋標(biāo)記，對(duì)于標(biāo)記后成陽(yáng)性的說(shuō)明基因已整合到黑林1號(hào)楊的細(xì)胞中，可以進(jìn)行選用。將農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化可以成功的將外源抗蟲(chóng)害的毒蛋白基因?qū)牒诹?號(hào)楊的受體中，為黑林1號(hào)楊的遺傳與轉(zhuǎn)化提供了理論依據(jù)，并幫助黑林1號(hào)楊在生長(zhǎng)過(guò)程中抵抗病蟲(chóng)害的侵害。轉(zhuǎn)化成功后可以優(yōu)化黑林1號(hào)楊的抗病蟲(chóng)害遺傳轉(zhuǎn)化體系，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)達(dá)到3天時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化到葉片的農(nóng)桿菌開(kāi)始變多，繼續(xù)培養(yǎng)后在增加卡那霉素的濃度后葉片會(huì)有一個(gè)修復(fù)的過(guò)程。轉(zhuǎn)化后可以利用PCR進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)有3株抗病蟲(chóng)害芽出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)后，可以對(duì)其進(jìn)行DNA對(duì)照，當(dāng)陽(yáng)性率達(dá)到100%時(shí)可以證明蜘蛛殺蟲(chóng)Bt基因蛋白已進(jìn)入并整合到黑林1號(hào)楊的基因組合中。

3 結(jié)語(yǔ)

利用蜘蛛殺蟲(chóng)膚加上Bt毒性蛋白基因?qū)诹?號(hào)楊進(jìn)行基因遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行檢測(cè)，可以探討轉(zhuǎn)基因外源基因與抗蟲(chóng)性的關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行一定數(shù)量黑林1號(hào)楊的組培苗的繁殖，可以在抗蟲(chóng)性測(cè)試基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)效果，使黑林1號(hào)楊在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中減少病蟲(chóng)害的侵害。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介：任立，本科學(xué)歷，工程師，研究方向：基層林業(yè)生產(chǎn)及技術(shù)推廣。