D-手性肌醇對(duì)db/db小鼠降血糖和肝臟保護(hù)作用及機(jī)制

范春雪，魏 敏，張丹丹，高慶瑤，黃菡雪，王建行，韓淑英

(華北理工大學(xué)1. 藥學(xué)院、2. 臨床醫(yī)學(xué)院、3. 冀唐學(xué)院、4. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、5. 河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000)

2型糖尿病的發(fā)展會(huì)導(dǎo)致多種并發(fā)癥，肝損傷是其中之一[1-2]。肝臟與糖脂代謝密切相關(guān)[3]，探究保護(hù)糖尿病肝損傷的作用機(jī)制，對(duì)于糖尿病的治療和預(yù)后都很重要。

D-手性肌醇(D-chiro-inositol，DCI)是羥基環(huán)己醇的一種手性結(jié)構(gòu)，具有促進(jìn)肝臟脂代謝、胰島素增敏、降血糖、抗氧化等作用[4]，有希望應(yīng)用于2型糖尿病的臨床治療[5]。目前，已有文獻(xiàn)對(duì)DCI降低血糖的機(jī)制進(jìn)行初步探究，表明DCI通過(guò)作用于PI3K/Akt信號(hào)通路，降低Ⅱ型糖尿病大鼠的血糖[6]。另有研究表明，DCI可以通過(guò)抑制肝糖輸出(hepatic glucose output， HGO)，在體內(nèi)發(fā)揮抗糖尿病作用[7]。但國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有關(guān)DCI對(duì)糖尿病肝臟保護(hù)作用機(jī)制的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予db/db小鼠不同劑量DCI，觀察DCI的降糖作用及其對(duì)肝損傷的抑制作用，并探討可能機(jī)制，為DCI進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物35只10周齡♀SPF級(jí)db/db小鼠(體質(zhì)量39～48 g)，10只同源同周齡♀ db/m小鼠(體質(zhì)量17～20 g)，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0010，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。60Co輻射小鼠顆粒飼料(南京貝斯弗飼料有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20171050001MF01)。

1.2藥物與試劑DCI(Sigma公司，Lot：#BCBQ3950V，貨號(hào)：101678071，白色結(jié)晶，純度99%)；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine amino-transferase,ALT)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)C010-2、C009-2)；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (glucose transporters 4，GLUT4)抗體(武漢博士德公司，貨號(hào)：BM2162)；胰島素受體底物2(insulin receptor substrate 2，IRS2)抗體[EPR904(2)](Abcam公司，貨號(hào)：ab134101)；胰島素受體(insulin receptor，IR)抗體(Gene Tex公司，貨號(hào)：GTX101136)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：PT0001)；Masson染色試劑(索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20160913)。

1.3儀器羅氏血糖儀及配套血糖試紙(德國(guó)羅氏診斷有限公司)；200PRO酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；Universal Hood Ⅲ凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè))；5180R高速低溫離心機(jī)(Eppendorf公司)；HMIAS-2000真彩病理圖像分析系統(tǒng)(高騰科技有限公司)；BX5光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(Leica公司)；H-7650透射電鏡(日本日立公司)。

2 方法

2.1小鼠分組與給藥將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，測(cè)定隨機(jī)血糖值，連續(xù)2次血糖均值>16.1 mmol·L-1的納入實(shí)驗(yàn)，選取符合要求的30只小鼠(剔除血糖和體質(zhì)量差異較大的小鼠)，隨機(jī)分為模型對(duì)照組(MCG)、高劑量DCI組(HDCI)和低劑量DCI組(LDCI)；db/m為正常對(duì)照組(NCG)。每組10只。HDCI與LDCI給藥量分別70、35 mg·kg-1·d-1，MCG與NCG給予同體積純水。于每日上午9時(shí)按照體質(zhì)量分別灌胃，持續(xù)6周。

2.2觀察指標(biāo)

2.2.1一般表征觀察 給藥期間密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、毛色及大小便等有無(wú)改變。每周測(cè)定小鼠的飲水量、進(jìn)食量和體質(zhì)量變化。

2.2.2血糖測(cè)定 首次給藥血糖動(dòng)態(tài)觀察：用血糖儀測(cè)定第1次給藥前及給藥后禁食0、1、2、4 h的血糖。隨機(jī)血糖測(cè)定：于給藥0周、2周、4周、6周，測(cè)定db/db小鼠隨機(jī)血糖(給藥后2 h)。

2.2.3血清AST、ALT和肝重指數(shù)測(cè)定 末次給藥后，禁食14 h，吸入性七氟烷麻醉(將小鼠口鼻對(duì)準(zhǔn)含七氟烷瓶口約5～6 s)小鼠，迅速摘眼球取血于1.5 mL EP管中，分離血清。微板法測(cè)定血清中AST和ALT的水平。小鼠取血后，立即剖腹取肝臟，于生理鹽水中漂洗，用濾紙吸去表面液體，稱重。計(jì)算肝重指數(shù)(liver weight index，LI)，LI/%=肝重/體重×100%。

2.2.4肝臟病理形態(tài)觀察 肝臟稱重后，于小鼠肝臟右葉切取1 mm3組織塊，用體積分?jǐn)?shù)為0.025戊二醛溶液固定12 h，磷酸緩沖液沖洗8 h，體積分?jǐn)?shù)為0.01鋨酸中浸泡2 h，沖洗脫水后使用Epon812包埋，切片(70 nm)，使用枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察、拍照。

切取適宜大小肝臟右葉于體積分?jǐn)?shù)為0.04多聚甲醛中固定72 h，修塊置于包埋盒中，純水沖洗8 h，常規(guī)石蠟包埋處理(軟、硬蠟比例為1 ∶3)，4 μm厚切片。于65℃烤片2 h，進(jìn)行常規(guī)HE染色；按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行Masson染色。光鏡下觀察db/db小鼠肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

2.2.5免疫組織化學(xué)法測(cè)定肝組織GLUT4蛋白的表達(dá) 將肝臟組織石蠟切片脫蠟水化，EDTA高壓加熱煮沸修復(fù)抗原，PBS洗凈，封閉血清，一抗GLUT4以1 ∶200稀釋覆蓋組織切片，置于冰箱中4℃過(guò)夜，PBS沖洗后滴加二抗，置于37℃恒溫箱中孵育，沖洗后，DAB試劑顯色50 s，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1 min。改用PBS代替一抗，其他實(shí)驗(yàn)條件相同進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)設(shè)為陰性對(duì)照組。光鏡下可見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色，觀察GLUT4蛋白表達(dá)及分布，并應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定平均積分吸光度。

2.2.6Western blot檢測(cè)IR和IRS-2蛋白表達(dá) 冰上切取凍存肝臟組織約30 mg，加300 μL RIPA裂解液，低溫高速勻漿3次，冰上裂解2 h，4℃離心吸取上清2次，BCA蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度為5 g·L-1。樣品中加入5×loading buffer，沸水浴變性，上樣量20 μL。配制12%分離膠用于IRS2(137 ku)的檢測(cè)，配制8%分離膠用于IR(30 ku)的檢測(cè)，配制5%濃縮膠。電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉；加入一抗(IR 1 ∶1 000，IRS-2 1 ∶1 000)4℃搖床過(guò)夜，TBST洗滌3次；加入二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次；吸取顯影液(1 ∶1)200 μL均勻涂在膜上，置于自動(dòng)顯影儀中顯影。應(yīng)用Image J軟件測(cè)定IR、IRS-2與β-actin顯影條帶的灰度值，內(nèi)參為β-actin。

3 結(jié)果

3.1DCI對(duì)db/db小鼠一般表征的影響NCG組小鼠精神狀態(tài)良好、活潑好動(dòng)、反應(yīng)敏捷、毛發(fā)光亮；MCG組小鼠精神萎靡、動(dòng)作遲緩、毛發(fā)稀疏無(wú)光澤、多飲、多食、多尿；高、低劑量DCI干預(yù)組小鼠上訴一般表征有不同程度的改善，HDCI改善更明顯。

3.2DCI對(duì)db/db小鼠血糖的影響

3.2.1DCI首次給藥對(duì)db/db小鼠血糖的影響 首次給予DCI后禁食，觀察小鼠血糖動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)Tab 1，NCG組禁食4 h血糖無(wú)明顯變化，MCG、HDCI、LDCI組各點(diǎn)血糖值明顯高于NCG組(P<0.01)；與MCG組相比，高、低劑量DCI給藥后各時(shí)間點(diǎn)血糖值均有不同程度降低，LDCI組與MCG組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)，HDCI組血糖下降明顯(P<0.01)；高、低劑量給藥組進(jìn)行比較，給藥后1、2、4 h存在明顯差異(P<0.01)，高劑量DCI組血糖值下降更明顯。

3.2.2DCI對(duì)db/db小鼠隨機(jī)血糖影響的動(dòng)態(tài)觀察 DCI對(duì)db/db小鼠隨機(jī)血糖的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)Tab 2，給藥6周內(nèi)NCG組隨機(jī)血糖無(wú)變化，MCG組隨機(jī)血糖明顯高于NCG組(P<0.01)，且第6周最高；與MCG組相比，LDCI組和HDCI組隨機(jī)血糖不同程度地下降(P<0.01)，其中給藥第4 周降低幅度最大。HDCI組隨機(jī)血糖值與LDCI組比較沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。

Tab 1 Effects of DCI on blood glucose for first time in db/db

**P<0.01vsNCG;##P<0.01vsMCG;△△P<0.01vsHDCI

Tab 2 Effects of DCI on random blood glucose in db/db

**P<0.01vsNCG;##P<0.01vsMCG

3.2.3DCI對(duì)db/db小鼠血清AST、ALT和肝重指數(shù)的影響 Tab 3結(jié)果顯示，MCG組小鼠血清AST活性高于NCG組(P<0.05)；高、低劑量DCI對(duì)血清AST有不同程度降低作用，但與NCG、MCG組相比，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各組db/db小鼠血清ALT活性明顯較db/m小鼠升高(P<0.01)；HDCI與LDCI組血清ALT值有降低趨勢(shì)，但與MCG組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。各組db/db小鼠LI值明顯高于db/m小鼠(P<0.01)，LDCI和HDCI組LI值較MCG組略有升高(P>0.05)。

Tab 3 Effects of DCI on serum AST and ALT levels

*P<0.05,**P<0.01vsNCG

3.3DCI對(duì)db/db小鼠肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig 1A的HE染色結(jié)果顯示，各組小鼠肝組織細(xì)胞核被染成藍(lán)色，肝細(xì)胞質(zhì)被染成粉紅色。NCG組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)染色均勻，未出現(xiàn)水腫，肝小葉清晰，未出現(xiàn)脂肪變性；MCG組小鼠肝細(xì)胞條索狀排列基本消失，肝細(xì)胞明顯腫脹變形，有部分肝細(xì)胞發(fā)生溶解性壞死，可見(jiàn)有炎細(xì)胞大量聚集，肝血竇狹窄或閉鎖，大量肝細(xì)胞脂肪變性，形成脂滴空泡；與MCG組相比，HDCI組、LDCI組小鼠肝臟的病理變化明顯減輕，肝細(xì)胞基本呈條索狀排列，脂滴空泡有所減少。HDCI組小鼠肝組織損傷減輕更明顯。

Fig 1B的Masson染色結(jié)果顯示，NCG組小鼠肝組織只在門靜脈處見(jiàn)少許藍(lán)染物質(zhì)，MCG組則出現(xiàn)明顯的藍(lán)色膠原纖維，主要分布在血管、匯管區(qū)及Disse間隙；LDCI組與HDCI組藍(lán)染膠原纖維較MCG組明顯減少。

Fig 1C的透射電鏡結(jié)果顯示，NCG組小鼠肝細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，線粒體豐富；MCG組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，線粒體減少、變形，正常結(jié)構(gòu)幾乎消失，可見(jiàn)散在脂滴和大量膠原纖維；HDCI組和LDCI組較MCG組肝細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善，少見(jiàn)膠原纖維。

3.4DCI對(duì)db/db小鼠肝臟組織中GLUT4、IR和IRS2蛋白表達(dá)的影響

3.4.1免疫組化法檢測(cè)GLUT4蛋白表達(dá) 如Fig 2所示，NCG組小鼠肝臟組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上出現(xiàn)大量的棕黃色染色，且分布均勻，為高表達(dá)，細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。MCG組小鼠肝臟細(xì)胞中GLUT4蛋白表達(dá)程度偏低，可見(jiàn)少許棕黃色顆粒分布。HDCI組與LDCI組GLUT4的表達(dá)明顯高于MCG組，棕黃色陽(yáng)性染色大面積分布，且表達(dá)均勻，但HDCI組染色切片總體顏色要深于LDCI組。計(jì)算GLUT4陽(yáng)性表達(dá)百分比結(jié)果表明，MCG組GLUT4的蛋白表達(dá)明顯低于NCG組(P<0.01)；HDCI組的GLUT4表達(dá)明顯高于MCG組(P<0.01)；HDCI組的表達(dá)最高，與NCG組結(jié)果相近(P>0.05)；HDCI組明顯高于LDCI組(P<0.01)。

3.4.2Western blot法檢測(cè)IR、IRS2蛋白表達(dá) 如Fig 3所示，MCG組IR表達(dá)明顯低于NCG組(P<0.01)；高劑量DCI組IR蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組、NCG組和LDCI組(P<0.01)；低劑量DCI組與MCG組比較結(jié)果相近(P>0.05)。MCG組IRS2蛋白表達(dá)低于NCG組(P<0.01)；高劑量DCI組表達(dá)水平與MCG組比較明顯升高(P<0.01)，與NCG組表達(dá)結(jié)果相近(P>0.05)；低劑量DCI組IRS2的表達(dá)水平高于MCG組和NCG組(P<0.01)，與HDCI組表達(dá)結(jié)果無(wú)差異(P>0.05)。

Fig 2 Immunohistochemistry of GLUT4 protein expression in hepatic tissues of db/db

4 討論

2型糖尿病嚴(yán)重危害人類健康，該病可致多種器官的損傷，尤以肝損傷更為明顯，長(zhǎng)期高血糖能發(fā)展成為各種肝臟的并發(fā)癥[8]。db/db小鼠是國(guó)際公認(rèn)的自發(fā)2型糖尿病動(dòng)物模型，具有典型的高血糖、肥胖和肝、腎等器官損傷的特點(diǎn)[9]，該小鼠瘦素受體基因自然突變而缺陷，4周齡開(kāi)始出現(xiàn)血糖升高和肥胖，早期肝就可出現(xiàn)脂肪性病變，隨著時(shí)間推移肝臟逐漸向纖維化、肝硬化發(fā)展[10]。

Fig 3 Western blot of IR and IRS2 in hepatic

*P<0.05, **P<0.01 vs NCG; #P<0.05, ##P<0.01 vs MCG; △P<0.05, △△P<0.01 vs HDCI

本文應(yīng)用db/db小鼠動(dòng)物模型，觀察了DCI口服給藥對(duì)db/db小鼠血糖和肝損傷的影響，并探討其可能機(jī)制。結(jié)果表明，DCI首次給藥1 h就能明顯降低db/db小鼠血糖，連續(xù)給藥6周能持續(xù)降低隨機(jī)血糖，高劑量DCI降血糖作用更明顯。說(shuō)明DCI降糖作用起效較快、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，進(jìn)一步證明了DCI有較好的降低血糖作用。通過(guò)觀察血清AST、ALT、肝重指數(shù)及肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，考察DCI對(duì)糖尿病肝損傷的影響情況。結(jié)果顯示，DCI對(duì)db/db小鼠血清AST和ALT有一定的降低作用，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，是由于實(shí)驗(yàn)后期模型組小鼠肝損傷已經(jīng)非常嚴(yán)重，大部分肝細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生脂肪變性壞死，產(chǎn)生AST和ALT明顯減少，所以給藥組與模型組比較無(wú)明顯差異；肝重指數(shù)給藥組略高于模型對(duì)照組(無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)，是由于模型組體質(zhì)量較高，所以肝重指數(shù)有一定程度升高，但DCI是否有一定的抑制脂肪生成作用，有待深入研究。從光鏡和電鏡觀察可見(jiàn)，DCI可減輕肝組織的脂肪變性、纖維化程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的損傷，緩解了db/db小鼠肝臟損傷的進(jìn)展程度。應(yīng)用免疫印跡和免疫組化法進(jìn)一步探究了DCI的作用機(jī)制，通過(guò)測(cè)定肝組織IR、IRS2、GLUT4的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，DCI可不同程度上調(diào)IR、IRS2和GLUT4蛋白的表達(dá)，HDCI組表達(dá)上調(diào)更明顯。說(shuō)明DCI是通過(guò)影響IR、IRS2及GLUT4的表達(dá)，在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮積極作用，從而有效緩解胰島素抵抗，降低血糖。

IR是與胰島素結(jié)合的靶蛋白，大量存在于肝臟細(xì)胞膜上，激活后促使IRS磷酸化，從而進(jìn)行下一步的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明，IR表達(dá)的下調(diào)會(huì)使人體內(nèi)胰島素抵抗，IR的過(guò)量表達(dá)會(huì)對(duì)糖尿病患者造成低血糖的風(fēng)險(xiǎn)[11]。IRS2是IR下端信號(hào)因子，IRS2在促進(jìn)肝臟糖原合成，以及抑制HGO中具有重要作用[12]。GLUT4是細(xì)胞中胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)末端因子，其主要作用為促使胞外葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。

DCI在胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用。張澤生等[4,14]報(bào)道，人體內(nèi)缺乏DCI會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗，DCI能有效增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量，促進(jìn)2型糖尿病大鼠糖原的合成，改善胰島素抵抗。本研究結(jié)果也證明了DCI的降糖作用，但從IR、IRS2和GLUT4蛋白表達(dá)的角度探究DCI的作用機(jī)制，目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。有文獻(xiàn)報(bào)道，DCI有抗氧化、降低肝臟脂質(zhì)含量，并能緩解酒精性脂肪肝的作用[15]。本研究首次從胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為基礎(chǔ)，探究DCI對(duì)糖尿病肝損傷的保護(hù)作用和作用機(jī)制，表明DCI對(duì)糖尿病肝損傷有明顯的抑制作用。

綜上所述，DCI具有降低db/db小鼠血糖，抑制胰島素抵抗，減輕肝臟組織的脂肪變性和抑制肝臟纖維化的作用。推斷可能是由于DCI提高了小鼠肝臟組織中的IR、IRS2和GLUT4蛋白的表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖的攝取利用，緩解了胰島素抵抗，降低血糖，從而產(chǎn)生保護(hù)肝臟的作用。但DCI的作用機(jī)制可能是多靶點(diǎn)多途徑，還需要進(jìn)一步的研究。