銀椴苷抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究

仲維蘭，劉 紅，魯美鈺，范瑤瑤，梁曉琳，張 涵，盧法榮，徐茂磊，周 玲

(1. 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院“方劑效應(yīng)與臨床評價”國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺 264003；2. 山東博安生物技術(shù)有限公司，山東 煙臺 264670)

胰腺癌是一種危害人類消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，在我國，其致死率位居惡性腫瘤第6位[1]。胰腺癌位置隱蔽，且早期癥狀不明顯，80%的患者就診時已屬于晚期，僅有少數(shù)患者具有手術(shù)切除的機(jī)會。放療、化療及靶向治療作為胰腺癌非手術(shù)治療手段，在臨床上具有重要作用。然而，胰腺癌對放療有很高的耐受性，故臨床上較少使用。吉西他濱作為胰腺癌治療的金標(biāo)準(zhǔn)，單用或聯(lián)合其他化療藥物雖延長了胰腺癌患者的生存期，但其療效仍不盡人意[2]。Rocha等[3]認(rèn)為，僅局限于吉西他濱聯(lián)合其他化療藥物的治療方案并不能有效改善胰腺癌的治療效果。因此，尋求有效的胰腺癌治療藥物是亟待解決的問題。

膽固醇作為一種具有羥基的固體醇類化合物，是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要組成成分。另一方面，膽固醇是脂質(zhì)雙分子中脂筏結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組成部分，通過調(diào)節(jié)脂筏結(jié)構(gòu)，影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。惡性腫瘤細(xì)胞增殖時，膽固醇的攝取增多，合成加速[4-5]。已有研究證實(shí)，抑制膽固醇的合成和吸收能有效抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖[6]。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA reductase，HMGCR)是膽固醇生物合成的關(guān)鍵酶，參與生物體內(nèi)各種內(nèi)源性膽固醇的生物合成。研究表明，HMGCR抑制劑他汀類藥物具有良好的抗胰腺癌作用[7]。此外，Guillaumond等[8]研究發(fā)現(xiàn)，通過降低參與膽固醇攝取的低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)的表達(dá)，可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。

銀椴苷是從仙鶴草中提取的一種黃酮糖苷類化合物。研究表明，銀椴苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗高血壓、抗糖尿病等藥理學(xué)活性[9-12]。然而，銀椴苷抗腫瘤活性鮮有報(bào)道。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)銀椴苷具有抗胰腺癌作用，但是銀椴苷是否能夠抑制胰腺癌細(xì)胞增殖及其相關(guān)機(jī)制并不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在研究銀椴苷對胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的抑制作用，并圍繞膽固醇的合成和吸收在胰腺癌細(xì)胞增殖中的作用，初步探討銀椴苷抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，為銀椴苷用于胰腺癌的防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人胰腺癌PANC-1細(xì)胞購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。

1.1.2藥物與試劑 銀椴苷購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco； MTT購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所；細(xì)胞周期檢測試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司；抗細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cylin-dependent protein kinase 1，CDK1)、細(xì)胞周期素Bl(Cyclin B1)、HMGCR、LDLR抗體，購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體，購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.1.3儀器 Epoch全波長酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；BIoDoc-IT Imaging System凝膠成像系統(tǒng)(德國UVP公司)；PCR擴(kuò)增儀、電泳裝置(美國Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；ESCO二級生物安全柜(新加坡ESCO公司)；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞活力檢測 運(yùn)用MTT法檢測銀椴苷對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞生長抑制作用。將PANC-1細(xì)胞按照5×106·L-1的濃度接種到96孔板中培養(yǎng)過夜。24 h后，于每孔加入不同濃度的銀椴苷(0、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)處理。培養(yǎng)相應(yīng)時間后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱避光孵育，4 h后，每孔加入100 μL DMSO以溶解甲臜，待甲臜充分溶解后，利用酶標(biāo)儀讀取490 nm處吸光光度值，并計(jì)算細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率/%=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.2.2細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 人胰腺癌PANC-1細(xì)胞以500個/孔鋪于6孔板中，于孵育箱中過夜使其貼壁生長。次日，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入不同濃度銀椴苷(0、25、50、100 μmol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，更換正常的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)15 d，每隔3 d更換培養(yǎng)基。待有肉眼可見的細(xì)胞集落后，用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗凈染色液，自然晾干、拍照、顯微鏡下計(jì)數(shù)，大于50個細(xì)胞為1個克隆數(shù)。

1.2.3細(xì)胞周期檢測 將PANC-1細(xì)胞以3×109·L-1密度種于6孔板中，于37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁生長后，加入不同濃度銀椴苷(0、25、50、100 μmol·L-1)處理48 h，收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，利用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，每管加入70%冷乙醇500 μL，緩慢吹成細(xì)胞懸液，4℃固定過夜，染色前用1 mL預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次以去除固定液，加入500 μL PI/RaseA染料，混勻，室溫避光染色30 min，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測PANC-1細(xì)胞周期的分布。

1.2.4Western blot 檢測CDK1、Cyclin B1、HMGCR、LDLR 蛋白表達(dá)變化 PANC-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的銀椴苷處理48 h后，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入適量RIPA與蛋白磷酸酶抑制劑混合液(RIPA ∶蛋白磷酸酶抑制劑=100 ∶1)，4℃裂解30 min，12 000 r·min-1低溫離心20 min，收集上清液于1.5 mL EP管內(nèi)。BCA法測定蛋白的濃度。取100 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上，5%的脫脂牛奶封閉4 h，分別加入CDK1、Cyclin B1、HMGCR、LDLR、β-actin 抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗膜3次，加入ECL試劑，顯影，用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.5RT-PCR檢測mRNA水平的變化 利用TRIzol提取PANC-1細(xì)胞總RNA，利用核酸測定儀測定RNA的含量和純度。根據(jù)總RNA的含量，按照試劑盒說明將其逆轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共34個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers sequences used for RT-PCR reactions

2 結(jié)果

2.1銀椴苷對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的生長抑制作用不同濃度銀椴苷(0、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)處理PANC-1細(xì)胞24、48、72 h后，用MTT法檢測細(xì)胞活力。如Fig 1所示，與對照組相比，銀椴苷處理組的細(xì)胞存活率明顯減少，且呈時間和濃度依賴性。

2.2銀椴苷對PANC-1細(xì)胞克隆形成能力的影響細(xì)胞克隆形成可反映細(xì)胞的增殖能力和致瘤性。如Fig 2所示，經(jīng)不同濃度銀椴苷(25、50、100 μmol·L-1)處理后，PANC-1細(xì)胞克隆形成能力明顯減弱，表明銀椴苷可抑制PANC-1細(xì)胞克隆形成能力。

2.3銀椴苷對PANC-1細(xì)胞周期的影響采用流式PI單染，檢測銀椴苷對PANC-1細(xì)胞周期的影響。如Fig 3所示，PANC-1細(xì)胞經(jīng)銀椴苷(25、50、100 μmol·L-1)處理48 h后，細(xì)胞阻滯在G2/M期。與對照組相比，銀椴苷(25、50、100 μmol·L-1)處理PANC-1細(xì)胞48 h后，G2/M期的細(xì)胞分別增加至(14.37±1.21)%、(27.9±3.20)%、(38.09±2.76)%。表明隨著銀椴苷濃度的升高，處于G2/M期細(xì)胞明顯增加。

Fig 1 Effects of different concentrations of tiliroside onviability of PANC-1 cells measured by n=5)

2.4銀椴苷對PANC-1細(xì)胞中CDK1和CyclinB1表達(dá)的影響Cyclin B1與CDK1結(jié)合，參與G2/M期控制點(diǎn)的調(diào)控，從而推動細(xì)胞周期的進(jìn)行。為此，本研究運(yùn)用Western blot檢測銀椴苷是否影響Cyclin B1與CDK1蛋白的表達(dá)。結(jié)果如Fig 4所示，銀椴苷(25、50、100 μmol·L-1)處理48 h后，PANC-1細(xì)胞中Cyclin B1蛋白表達(dá)下調(diào)，同時CDK1的表達(dá)也明顯下調(diào)。這進(jìn)一步證實(shí)，細(xì)胞周期阻滯是銀椴苷抑制PANC-1細(xì)胞增殖的重要因素。

Fig 2 Effects of tiliroside on colonyA: The images of the colonies; B: Number of colonies.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 3 Effects of tiliroside on cell cycle of PANC-1 n=3)

2.5銀椴苷對PANC-1細(xì)胞中HMGCR與LDLR表達(dá)的影響已有研究表明，胰腺癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平密切相關(guān)。因此，本研究運(yùn)用RT-PCR和Western blot檢測了銀椴苷對PANC-1細(xì)胞中膽固醇合成的限速酶HMGCR及膽固醇吸收關(guān)鍵蛋白LDLR表達(dá)的影響。結(jié)果表明，銀椴苷(25、50、100 μmol·L-1)處理PANC-1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中HMGCR、LDLR mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果提示，銀椴苷抑制PANC-1細(xì)胞增殖可能與其下調(diào)HMGCR與LDLR的表達(dá)有關(guān)(Fig 5)。

Fig 4 Effects of triliside on expression of CDK1and Cyclin B1 in PANC-1 n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3 討論

在抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)過程中，天然產(chǎn)物起著重要的作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有2/3的抗腫瘤藥物來源于天然產(chǎn)物。銀椴苷是來源于仙鶴草的一種黃酮糖苷類化合物。研究表明，銀椴苷具有抗糖尿病、抗高血壓、抗氧化等藥理學(xué)作用[9-12]，但銀椴苷抗胰腺癌作用尚未見報(bào)道。本研究中，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，銀椴苷可抑制PANC-1細(xì)胞增殖，平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，銀椴苷能明顯抑制PANC-1細(xì)胞的克隆形成能力，這進(jìn)一步說明銀椴苷可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞周期阻滯是藥物抑制細(xì)胞增殖的重要方式之一[13-14]。本研究中對細(xì)胞周期的檢測結(jié)果表明，銀椴苷可以將PANC-1細(xì)胞阻滯在G2/M期。CDK1與Cyclin B1是細(xì)胞周期由G2期過渡到M期的關(guān)鍵蛋白。Western blot結(jié)果表明，銀椴苷能抑制CDK1和Cyclin B1蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果提示，誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞周期阻滯可能是銀椴苷抑制人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的重要原因。

Fig 5 Expression of LDLR and HMGCR mRNA(A) andprotein(B) in PANC-1 after tiliroside treament for 48

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

通過腫瘤細(xì)胞代謝異常的研究發(fā)現(xiàn)，增殖迅速的腫瘤細(xì)胞的一個明顯代謝特點(diǎn)為脂質(zhì)生成增多[15]。膽固醇是細(xì)胞膜的關(guān)鍵組成部分，其攝入或合成過多在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4-5]。細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平取決于膽固醇的內(nèi)源性合成和外源性攝取，其中HMGCR是膽固醇內(nèi)源性合成的限速酶。研究表明，HMGCR抑制劑他汀類藥物具有抗胰腺癌作用[7]。此外， Guillaumond等[8]研究發(fā)現(xiàn)，敲除LDLR能有效抑制胰腺癌細(xì)胞增殖。我們的研究發(fā)現(xiàn)，銀椴苷能在mRNA和蛋白水平抑制HMGCR及LDLR的表達(dá)。這表明抑制HMGCR及LDLR的表達(dá)，降低人胰腺癌PANC-1細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平可能是銀椴苷誘導(dǎo)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯的重要原因。

綜上所述，銀椴苷可抑制人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖，并伴隨著G2/M期細(xì)胞周期阻滯，其機(jī)制可能與銀椴苷抑制膽固醇內(nèi)源性合成限速酶HMGCR及膽固醇外源性攝取關(guān)鍵蛋白LDLR表達(dá)有關(guān)。該研究結(jié)果將為銀椴苷開發(fā)成為抗腫瘤藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：衷心感謝濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院新藥技術(shù)開發(fā)中心的老師和同學(xué)的熱心幫助。)