miR-369-5p對SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞活化增殖的影響

代 晨，陶 輝，石開虎，徐盛松

(安徽醫(yī)科大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院心胸外科；2.心血管病研究中心，安徽 合肥 230601)

心肌纖維化是各種因素作用于心臟，引起持續(xù)性心肌損傷的病理改變過程，是心肌重構(gòu)的重要特征，也是許多常見心血管疾病的病理基礎(chǔ)，其主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維過量積聚及膠原成分的改變[1]。心肌纖維化在心房顫動的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，是心房顫動的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅著人類的健康[2]。目前，心肌纖維化形成的具體機(jī)制尚未明確，但已明確心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)的活化增殖是心肌纖維化形成的重要環(huán)節(jié)。心肌間質(zhì)主要由CFs構(gòu)成，其表型可轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步活化、增殖，并合成、分泌膠原纖維蛋白[3]。另有研究表明，微小核糖核酸(microRNAs，miRs)參與心血管系統(tǒng)疾病的生理及病理過程，miRs是一類內(nèi)源性、短鏈、非編碼的單鏈RNA[4]。文獻(xiàn)報道，miRs可參與調(diào)控心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展[5]，miR-369-5p作為miRs中的成員，可以誘導(dǎo)DNA組蛋白修飾的表觀遺傳重編程和去甲基化[6]，而甲基化又與心肌纖維化之間存在著密切的關(guān)聯(lián)[7]。國內(nèi)外學(xué)者對心肌纖維化和miRs進(jìn)行了大量研究[8]，但miR-369-5p與心肌纖維化之間的作用關(guān)系研究尚未見報道。本研究以miR-369-5p為切入點(diǎn)，通過觀察其對CFs活化增殖的影響，探討miR-369-5p的可能作用機(jī)制，為心肌纖維化的預(yù)防和治療找到可能的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 40只♂ Sprague-Dawley(SD)乳鼠，清潔級，體質(zhì)量10 g左右，鼠齡3 d左右，購于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物許可證號：scxk(皖) 2017-001。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基、DMSO、CCK-8相關(guān)試劑(美國Sigma公司)；胎牛血清(Gibco公司)；microRNA-369-5p模擬物、microRNA-369-5p抑制物轉(zhuǎn)染試劑盒、Ez Omics One-Step qPCR試劑盒、U6 snRNA qRT-PCR試劑盒、Hairpin-it miRNA qRT-PCR試劑盒(吉瑪公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PremixExTapⅡ(2×) (TaKaRa公司)；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合；Ⅰ型膠原前膠原A1(type I collagen procollagen A1，Col1A1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、β-actin的一抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.3儀器 HR30-ⅡA2型生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Step One PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)；分光光度儀(德國Implen Gmb H公司)；TU-100恒溫金屬浴(上海一恒科技有限公司)；MK3酶標(biāo)儀(荷蘭雷勃公司)；倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2方法

1.2.1SD乳鼠CFs的提取與培養(yǎng) SD乳鼠用乙醇浸泡消毒30 s后處死，轉(zhuǎn)移至超凈臺,取出心臟，用PBS緩沖液沖洗數(shù)遍，洗凈血塊。將洗過后的心臟轉(zhuǎn)移至5 mL滅菌EP管中，用剪刀充分剪碎，加入3 mL的混合酶液(胰蛋白酶 ∶Ⅰ型膠原酶比例為2 ∶1)水浴鍋中消化，隨后靜置1 min，緩慢抽取上清液加入新滅菌離心管，再向其中加入等量的含血清DMEM培養(yǎng)基中和酶的消化，900 r·min-1離心8 min，重復(fù)操作3次，使組織塊消化充分，得到混合細(xì)胞，向各離心管中加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打數(shù)次，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中放置1.5 h后，換液貼壁的細(xì)胞即為CFs。顯微鏡下觀察通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定CFs，隨后將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，至3～4代可用于實驗，顯微鏡下觀察到應(yīng)用纖維黏連蛋白免疫組化染色陽性者即為CFs。

1.2.2實驗分組 實驗組：CFs瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物及抑制物；空白對照組：CFs不作轉(zhuǎn)染處理；陰性對照組：CFs瞬時轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒，不會對基因表達(dá)產(chǎn)生任何影響。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 CFs培養(yǎng)至對數(shù)生長期時可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗，將CFs消化后計數(shù)，等量接種至6孔板上，次日貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。實驗組miR-369-5p模擬物上游引物：5’-AGAUCGACCGUGUAUAUUCGC-3’,下游引物：5’-GAAUAUAACACGGUCGAUCUUU-3’； miR-369-5p抑制物的引物序列：5’-GCGAAUAUAACACGGUCGAUCU-3’；陰性對照組的引物序列：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。按照LipofectamineTM2000 Reagent 和miR-369-5p試劑盒的說明書對各分組的CFs進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，培養(yǎng)4～6 h，再更換常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于24、48 h進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取。

1.2.4提取總RNA及逆轉(zhuǎn)錄 提取細(xì)胞總RNA，分光光度儀測定RNA的濃度和純度，選擇適宜的RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照miRNAs試劑盒說明書操作加樣，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實時熒光定量PCR，檢測miR-369-5p的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：25℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，最后4℃保存。取cDNA進(jìn)行microRNA實時熒光定量PCR反應(yīng)：預(yù)變性95℃ 3 min，PCR反應(yīng)95℃ 12 s，62℃ 40 s，共進(jìn)行40個循環(huán)的擴(kuò)增。最后用U6作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCT法計算各組mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.5qPCR檢測各轉(zhuǎn)染組Col1A1、α-SMA的表達(dá) 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將各轉(zhuǎn)染組總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用 ABI Step One Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。設(shè)置反應(yīng)條件為：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s作為熔解曲線階段。β-actin設(shè)定為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCT法計算mRNA 的相對表達(dá)量。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.6Western blot法檢測CFs中Col1A1、α-SMA蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，向各細(xì)胞培養(yǎng)瓶分別加入1 mL RIPA解液和10 μL PMSF，吹打均勻裂解細(xì)胞，提取總蛋白，測蛋白濃度后，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，TBST洗膜2次，封閉1 h，再次洗膜4次，分別孵育α-SMA、β-actin、Col1A1的一抗，4℃搖床孵育過夜，洗膜后，二抗室溫孵育1 h，洗膜4次，采用ECL法顯影。結(jié)果采用Quantity One V 4.6軟件分析，根據(jù)測定出目的條帶吸光度值，計算 Col1A1、α-SMA的蛋白表達(dá)水平。

1.2.7CCK-8試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后CFs的增殖情況 設(shè)計分組：miR-369-5p模擬物組、miR-369-5p抑制物組、陰性對照組、空白組，每組設(shè)4個復(fù)孔。各轉(zhuǎn)染組的CFs處于對數(shù)生長期時用胰蛋白酶消化，加入DMEM中和消化，細(xì)胞計數(shù)。以細(xì)胞密度為5×106·L-1鋪于96孔板中，每孔200 μL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2 d。每孔加入10 μL CCK-8，避光孵育2 h后測定OD值，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物、抑制物對miR-369-5p表達(dá)的影響如Fig 1所示，CFs瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物、抑制物、陰性對照組及空白組后培養(yǎng)48 h，模擬物組相較于空白對照組及陰性對照組miR-369-5p的表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p抑制物的CFs中miR-369-5p表達(dá)明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 1 qPCR analysis of miR-369-5p expression after transient transfection of miR-369-5p mimics and miR-369-5p inhibitors in CFs for 48

*P<0.05,**P<0.01vsNC and vehicle

2.2轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物、抑制物對CFs細(xì)胞增殖的影響Fig 2結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物的CFs培養(yǎng)48 h后，實驗組細(xì)胞活力明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p抑制物的CFs培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞活力明顯高于空白對照組和陰性對照組 (P<0.05)。

Fig 2 Changes of MFs viability after 48 h of transient transfectionof miR-369-5p mimics and miR-369-5p

*P<0.05vsNC and vehicle

2.3瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物、抑制物對Col1A1、α-SMAmRNA表達(dá)的影響如Fig 3所示，CFs 瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物培養(yǎng)48 h后，Col1A1、α-SMA mRNA表達(dá)明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；瞬時轉(zhuǎn)染 miR-369-5p抑制物 48 h后，實驗組Col1A1、α-SMA mRNA表達(dá)明顯高于空白對照組和陰性對照組 (P<0.05)。

Fig 3 Changes of Col1A1 and α-SMA mRNA after transient transfection of miR-369-5p mimics and miR-369-5p inhibitors in CFs by

*P<0.05vsNC and vehicle

2.4轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物、抑制物對CFs中α-SMA、Col1A1蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物48 h后的CFs，Col1A1和α-SMA蛋白的表達(dá)量相較于空白對照組和陰性對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p抑制物48 h后的CFs，α-SMA、Col1A1蛋白表達(dá)相較于空白對照組和陰性對照組明顯升高(P<0.05)。

Fig 4 Changes of protein expression of Col1A1 and α-SMAin cardiac fibroblasts by Western

*P<0.05vsNC and vehicle

3 討論

在房顫心肌纖維化的發(fā)生過程中，CFs的部分表型改變及增殖活化對其有重要影響，心肌組織中有大量的CFs，而心肌細(xì)胞外基質(zhì)主要由CFs合成、分泌[9]。當(dāng)心肌由于各種致病因素受到損害時，CFs將會活化增殖，并轉(zhuǎn)化為肌成纖維母細(xì)胞，且能夠合成分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如Col1A1、α-SMA等。因此，心肌纖維化的發(fā)生主要通過CFs的活化增殖并過度表達(dá)Col1A1和α-SMA等細(xì)胞外基質(zhì)，從而使膠原的含量明顯增高，膠原纖維廣泛沉積于細(xì)胞外間質(zhì)，最終導(dǎo)致纖維化形成[10]。

miR是一種非編碼的內(nèi)源性單鏈小RNA，其由18～25個核苷酸構(gòu)成,可以與靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)形成不完全的互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)一步抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后的翻譯，或者促進(jìn)特定mRNA降解，來調(diào)控基因的表達(dá),從而對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等產(chǎn)生影響[11]。研究表明，miR可參與調(diào)控CFs活化增殖，與心肌纖維化密切相關(guān)，然而，miR-369-5p在CFs中的活化增殖機(jī)制尚不十分清楚。本課題通過在CFs中瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物和抑制物，通過與正常對照組和陰性對照組相比較，在瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物的CFs中，miR-369-5p的表達(dá)明顯上升；而在轉(zhuǎn)染了miR-369-5p抑制物的CFs中，miR-369-5p的表達(dá)明顯下降。在瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物組中α-SMA和Col1A1的表達(dá)下降，而在轉(zhuǎn)染了miR-369-5p抑制物組中α-SMA和Col1A1的表達(dá)水平升高。在CFs中瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物 48 h后，與空白對照組及陰性對照組相比，CFs活力明顯下降；而在CFs中瞬時轉(zhuǎn)染miR-369-5p抑制物 48 h后，同空白對照組及陰性對照組相比，CFs的活力明顯增強(qiáng)。

綜上所述，在CFs中轉(zhuǎn)染miR-369-5p模擬物后，miR-369-5p的表達(dá)量明顯增加，而CFs的活化增殖又可被miR-369-5p的高表達(dá)所抑制，進(jìn)而限制心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展，表明miR-369-5p是CFs 活化增殖潛在的靶分子之一。以上研究表明，miR-369-5p可能通過靶向調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)心肌纖維化，這也為探究miR-369-5p的具體作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)，同時也為干預(yù)和預(yù)防心肌纖維化提供了新思路。

(致謝：本實驗在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實驗室完成，感謝丁季飛、錢鵬、秦潤禾、汪裕琪提供的指導(dǎo)和幫助！)