人β防御素4對神經母細胞瘤細胞增殖凋亡及Caspase-3蛋白表達的影響

人β防御素4對神經母細胞瘤細胞增殖凋亡及Caspase-3蛋白表達的影響*

曹玉紅1張靜怡2張光運3曹艷華4

(1. 第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院兒科，陜西 西安 710032; 2. 西安交通大學醫(yī)學院第一醫(yī)院，陜西 西安 710061；

3.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經內科，陜西 西安 710032;4.濟南軍區(qū)總醫(yī)院兒科，山東 濟南250031)

【摘要】目的觀察人β防御素4(HBD4)對神經母細胞瘤(NB)細胞的殺傷作用,探討HBD4對NB細胞增殖、凋亡及Caspase-3蛋白表達的影響。方法將HBD4作用于NB細胞，根據HBD4終濃度將NB細胞分為A、B、C 3組，濃度分別為5、10、20 mg·L-1；HBD4作用時間分別為12、24、48h。噻唑藍(MTT)法測定HBD4對NB細胞增殖的抑制作用，流式細胞儀檢測HBD4作用于NB細胞后細胞凋亡情況；分光光度法檢測HBD4對NB細胞Caspase-3蛋白表達的影響。結果MTT檢測結果:NB細胞抑制率均隨HBD4濃度的升高而升高(P<0.01),隨HBD4作用時間的延長而升高(P<0.01)，提示HBD4對NB細胞的抑制作用具有時間和劑量依賴性；流式細胞儀檢測結果顯示：A、B、C三組NB細胞凋亡率均高于對照組(P<0.01)。三組NB細胞凋亡率比較亦有顯著差異(P<0.01)，說明隨藥物濃度的增加，細胞凋亡率呈增高趨勢； 分光光度法檢測結果顯示：A、B、C三組NB細胞Caspase-3含量均高于對照組(P<0.01)。三組NB細胞Caspase-3含量比較亦有顯著差異(P<0.01)，說明隨藥物濃度的增加，細胞Caspase-3含量呈增高趨勢。結論HBD4對NB細胞增殖具有抑制作用；HBD4可誘導NB細胞凋亡;HBD4可能是通過激活Caspase-3誘導NB細胞凋亡。

【關鍵詞】人β防御素4； 神經母細胞瘤； Caspase-3； 細胞凋亡

【中圖分類號】R 329.2+8【文獻標志碼】A

基金項目:陜西省自然科學基金(2012JM4054); 陜西省科技攻關計劃(2009K12-01)

通訊作者：張光運,E-mail: zhgyun@fmmu.edu.cn

收稿日期：( 2014-07-01； 編輯： 張文秀)

Influence of human β-defensin 4 on the proliferation, apoptosis and Caspase-3 protein expression of neuroblastoma cellsCAO Yuhong1, ZHANG Jinyi2, ZHANG Guangyun3,etal

(1.DepartmentofPediatrics,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China;

2.TheFirstAffiliatedHospitalMedicineCollegeofXi'anJiaoTongUniversity,Xi'an710061,China;

3.DepartmentofNeurology,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China;

4.DepartmentofPediatrics，GeneralHospitalofJinanMilitaryDistrict，Jinan250031，China)

Abstract【】ObjectiveTo examine cytotoxicity of human β defensin 4(HBD4)on neuroblastoma (NB) cell and explore the influence of human β-defensin 4 on proliferation, apoptosis and Caspase-3 protein expression of NB cells. MethodsIn this research, NB cells were treated with HBD4. According to final concentration of HBD4, NB cells were divided into 3 groups: A, B and C with the corresponding concentrations of 5, 10, and 20 mg.L-1, respectively. The reaction times were 12, 24 and 48h respectively. Methyhhiazolyldiphenyl- tetrazoliumbromide(MTT)assay was adopted to detect the inhibitory effect of HBD4 on NB cell proliferation. In addition, NB Cell apoptosis was assessed by flow cytometry and Caspase-3 activity was detected by spectrophotometry. ResultsMTT assay showed the inhibitory rate of NB cells treated with HBD4 increased with the increase of HBD4 concentration and the prolongation of acting time of HBD4(P<0.01), which indicated that HBD4 inhibited the proliferation of NB cells in a time and dose dependent manner. Flow cytometry assay showed that NB cell Apoptosis rates of group A, B and C were all higher than that of the control group(P<0.01), and there were statistically significant differences among the three groups(P<0.01), which suggested that the apoptosis rate increased with the increase of HBD4 concentration. In the third place, Spectrophotometry assay showed that Caspase-3 activity of group A, B and C were all higher than that of the control group(P<0.01), and the differences among the three groups were statistically significant(P<0.01), which suggested that the Caspase-3 activity increased with the increase of HBD4 concentration. ConclusionHBD4 inhibits the proliferation of NB cells by means of inducing cellular apoptosis via increasing Caspase-3 activity.

【Key words】Human β defensin 4; Neuroblastoma; Caspase-3; Apoptosis

神經母細胞瘤(NB)是兒童一種常見的惡性實體腫瘤，大部分患兒在就診時已廣泛轉移，病死率極高。傳統的放療或化療毒副作用大，對腫瘤細胞和正常細胞均有不同程度的殺傷作用，不可避免地造成多臟器損害。另外腫瘤細胞對多種抗癌藥物產生抗藥性，是腫瘤化療失敗的主要原因之一[1-4]。因此研究開發(fā)新一代毒副作用小、又能克服耐藥性的抗腫瘤藥物成為目前腫瘤防治研究的焦點。近幾年研究發(fā)現，一些具有廣譜殺菌活性的防御素，可以特異性殺傷某些腫瘤細胞，抑制腫瘤生長和增殖，但對正常人體細胞不造成破壞[5-12]。人β防御素4(HBD4)是2001年Jose-Ramon發(fā)現的一種新型β防御素。研究表明，HBD4對多種細菌具有殺傷作用，HBD4對人體各個系統的先天免疫尤其是粘膜和上皮的防御起非常重要的作用[13]。HBD4的抗腫瘤作用及其相關機制研究國內罕見報道。我們將HBD4作用于體外培養(yǎng)的NB細胞，觀察HBD4對NB細胞增殖及凋亡作用的影響，并初步探討其作用機制。

1材料與方法

1.1材料重組人β防御素4購自上海高創(chuàng)化學科技有限公司。細胞系：患兒，女，4歲，經病理證實為NB，Evans分期Ⅳ期，并全身骨髓轉移，術中取新鮮腫瘤標本，體外細胞培養(yǎng)，制備細胞系，已傳至45代。Caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。常規(guī)生化試劑為國產或進口分析純產品。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測HBD4對NB細胞增殖的影響取對數生長期NB細胞，制成細胞懸液,以1×104個/孔，接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入不同濃度HBD4,加DMEM培養(yǎng)液至200μL。實驗組根據HBD4終濃度將NB細胞分為A、B、C 3組，濃度分別為5、10、20mg·L-1。對照組只加DMEM培養(yǎng)液。HBD4作用時間分別為12、24、48h，每一濃度對應的每個時間點均做4個復孔，置37℃、50mL·L-1二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。培養(yǎng)到相應時間后，每孔加入MTT溶液[2g·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)]50μL，37℃孵育4h，棄上清，每孔加入二甲亞砜150μL，振蕩10min，測每孔A490nm值，根據公式：抑制率=(對照組A490nm-觀察組A490nm)/對照孔A490nm，計算抑制率。

1.2.2流式細胞儀檢測HBD4對NB細胞凋亡的影響接種對數生長期NB細胞于6孔培養(yǎng)板，1×105個/孔，每孔2mL。實驗組加入HBD4，使HBD4終濃度達到上述A、B、C 3個濃度，對照組設置同前，放人CO2孵箱中培養(yǎng)24h，胰酶消化，將細胞分別轉移至圓底離心管內，PBS洗滌，加入2mL預冷的70%酒精，4℃固定30min，PBS洗滌，加入核糖核酸酶A于5001μL 1×PBS中，37℃孵育30min，PBS洗滌，加入碘化丙啶于500μL 1×PBS中，室溫避光孵育30min，混勻，過300目篩網，置流式管中，進行細胞凋亡情況測定。

1.2.3分光光度法檢測HBD4對凋亡相關蛋白Caspase-3表達的影響取對數生長期細胞，調整細胞濃度為4×106個/mL，接種于48孔培養(yǎng)板，每孔250μL。實驗組及對照組設置同1.2.2，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，600g 4℃離心5min收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸除上清后，加入50μL裂解液，重懸細胞，冰浴裂解15 min。之后4℃ 16000g離心10min，上清轉移到預冷的離心管中。按照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書操作,加入AC-DEVD-pNA 10μL，上酶標儀405nm處檢測caspase-3活性。

2結果

2.1HBD4對NB細胞增殖的影響MTT檢測結果顯示：不同濃度HBD4作用于NB細胞相同時間，抑制率均隨濃度升高而升高(P<0.01)；相同濃度HBD4分別作用于NB細胞12，24，48h，抑制率隨時間延長而升高(P<0.01)，提示HBD4對NB細胞的殺傷作用具有時間和劑量依賴性,見表1。

表1　不同濃度HBD4對NB細胞的抑制率比較

2.2HBD4對NB細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示：A、B、C三組NB細胞凋亡率分別為(12.275±0.685) %、(18.300±0.356)%、(26.150±0.656)%，對照組凋亡率為(1.575±0.299)%，三組細胞凋亡率均高于對照組(P<0.01)。三組NB細胞凋亡率比較亦有顯著差異(P<0.01)，說明隨藥物濃度的增加，細胞凋亡率呈增高趨勢(表2)。

2.3HBD4對Caspase-3蛋白表達的影響A、B、C三組NB細胞Caspase-3 A值分別為0.155±0.013、0.245±0.013、0.328±0.010，對照組Caspase-3 A值為0.078±0.006，三組細胞凋亡率均高于對照組(P<0.01)。三組NB細胞Caspase-3含量比較亦有顯著差異(P<0.01)，說明隨藥物濃度的增加，細胞Caspase-3含量呈增高趨勢(表2)。

表2HBD4對NB細胞凋亡率及Caspase-3表達的影響

Table 2Influence of HBD4 on NB cell apoptosis and expression of caspase-3

組別細胞凋亡率(×10-2)caspase-3(A值)對照組1.575±0.2990.078±0.006A組12.275±0.6850.155±0.013B組18.300±0.3560.245±0.013C組26.150±0.6560.328±0.010F1540.909403.500P0.0000.000

3討論

國內外研究發(fā)現,防御素對白血病、淋巴瘤及多種實體瘤細胞如：肝癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌細胞等具有殺傷作用[5-13]。防御素對腫瘤細胞的殺傷活性大于非腫瘤細胞, 因此在相同劑量下, 防御素只能殺死腫瘤細胞, 對正常細胞無殺傷作用；體內防御素水平可能成為判斷某些腫瘤發(fā)生、療效及預后的生物指標。目前關于HBD4對NB細胞的殺傷作用及機制的研究國內外鮮見報道。本研究采用HBD4為研究藥物，觀察HBD4對NB細胞生長的影響，結果表明：HBD4對NB細胞有殺傷作用，并且其殺傷作用具有時間和劑量依賴性。這為NB患兒提供了一種新的治療方法。

盡管對防御素細胞毒作用的確切機制還不十分清楚, 但目前研究發(fā)現,防御素的抗腫瘤作用機制主要包括以下幾個方面：①對細胞膜的攻擊作用:腫瘤細胞表面較正常細胞帶有較多的負電荷, 通過靜電作用吸引大量含正電荷的防御素黏附于腫瘤細胞表面, 使腫瘤細胞膜的正常屏障破壞。細胞膜上的電壓依賴性離子通道形成, 導致細胞膜通透性增加, 胞內物質泄漏, 導致細胞死亡。②對腫瘤細胞骨架的斷裂作用。③對線粒體的損傷作用。④對染色體的破壞作用。⑤誘導腫瘤細胞凋亡等[14]。

凋亡途徑包括外在(細胞質) 和內在(線粒體)途徑。外在途徑是通過腫瘤壞死因子受體超家族成員的Fas死亡受體觸發(fā)引起; 內在途徑是刺激引起細胞色素C從線粒體釋放并激活死亡信號，而Caspase蛋白酶家族，在這個過程中起了重要作用，其中尤以Caspase-3被認為與真核細胞的凋亡密切相關，受到國內外學者的廣泛研究和關注。其機制主要是參與了凋亡信號的轉導和使DNA修復分子、細胞外基質蛋白、骨架蛋白等關鍵蛋白的失活等，而達到誘導細胞凋亡的作用[15]。已證明，高濃度的人中性粒細胞防御素1(HNP1)在體外對多種腫瘤細胞具有細胞毒性作用,可直接誘導腫瘤細胞凋亡[10]。由HNP1誘導的腫瘤細胞凋亡涉及這兩種途徑: 一方面, HNP1能促進淋巴細胞釋放出TNFA, 通過受體介導的細胞凋亡機制導致腫瘤細胞死亡; 另一方面, HNP1還可通過線粒體途徑介導腫瘤細胞凋亡。人β防御素1能抑制前列腺癌DU145 和PC3細胞生長,引起腫瘤細胞的快速溶解以及半胱天冬酶介導的前列腺癌細胞凋亡[9]。

4結論

HBD4對NB細胞增殖具有抑制作用;HBD4可誘導NB細胞凋亡,而且HBD4可能是通過激活Caspase-3誘導NB細胞凋亡。

【參考文獻】

[1]Sung KW. Treatment of high-risk neuroblastoma [J]. Korean J Pediatr, 2012, 55 (4): 115-120.

[2]Li K, Dong K, Gao J,etal. Neuroblastoma management in Chinese children [J]. J Invest Surg, 2012, 25(2):86-92.

[3]李仲榮. 神經母細胞瘤的臨床診斷與治療[J].實用兒科臨床雜志,2012,27(23):1781-1784.

[4]Matthay KK, George RE, Yu AL. Promising therapeutic targets in neuroblastoma [J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(10):2740-2753.

[5]Shuyi Y, Feng W, Jing T,etal. Human beta-defensin-3 (hBD-3) upregulated by LPS via epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling pathways to enhance lymphatic invasion of oral squamous cell carcinoma [J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2011, 112(5):616-625.

[6]Zhuravel E, Shestakova T, Efanova O,etal.Human beta-defensin-2 controls cell cycle in malignant epithelial cells: in vitro study[J]. Exp Oncol, 2011, 33(3):114-120.

[7]Winter J, Pantelis A, Reich R,etal. Human beta-defensin-1, -2, and -3 exhibit opposite effects on oral squamous cell carcinoma cell proliferation [J]. Cancer Invest, 2011, 29(3): 196-201.

[8]Yuhong Cao, Guang Yun Zhang，Sheng Quan Cheng，etal. Antitumor Activity of Human β Defensin 4 in Vitro [J]. Journal Of US-China Medical Science,2011,8(3):134-142.

[9]Bullard RS, Gibson W, Bose SK,etal. Functional analysis of the host defense peptide Human Beta Defensin-1: new insight into its potential role in cancer [J]. Mol Immunol, 2008, 45(3):839-848.

[10] Li D, Qin Q, Wang XY,etal. Intratumoral expression of mature human neutrophil peptide-1 potentiates the therapeutic effect of doxorubicin in a mouse 4T1 breast cancer model [J]. Oncol Rep, 2014, 31(3):1287-1295.

[11] Zhao L,Lu W. Defensins in innate immunity [J]. Curr Opin Hematol, 2014, 21(1):37-42.

[12] Li D, Wang W, Shi HS,etal. Gene therapy with Beta-defensin 2 induces antitumor immunity and enhances local antitumor effects [J]. Hum Gene Ther, 2014, 25(1):63-72.

[13] García JR, Krause A, Schulz S,etal. Human beta-defensin 4: a novel inducible peptide with a specific salt-sensitive spectrum of antimicrobial activity[J]. Faseb J, 2001, 15(10): 1819 -1821.

[14] 彭效祥,趙榮蘭. 防御素抗腫瘤的研究進展[J].中國腫瘤生物治療雜志,2010, 17(6): 687-691.

[15] 龍慧,李景和. TGF-β與Caspase 在腫瘤細胞凋亡中的作用[J]. 現代生物醫(yī)學進展, 2009, 9(13):2576-2578.