子癇前期患者子宮蛻膜自然殺傷細胞的表型研究

子癇前期患者子宮蛻膜自然殺傷細胞的表型研究

姜妮娜

(青島市膠州中心醫(yī)院, 山東 青島 266300)

【摘要】目的觀察先兆子癇患者子宮蛻膜自然殺傷細胞(dNK細胞)的表型。方法選取2012年12月至2013年5月在我院產(chǎn)科住院的30例子癇前期患者作為病例組，隨機選取同期在我院產(chǎn)前檢查正常的晚期妊娠婦女30例作為正常對照組。收集孕晚期子宮蛻膜組織，機械研磨加梯度離心法提取蛻膜內(nèi)單核細胞，流式細胞技術(shù)(FCM)篩選出dNK細胞，并檢測dNK細胞表面CD56及CD16的表達情況。結(jié)果病例組與正常對照組CD56bright CD16- CD3- dNK細胞的數(shù)量均明顯多于CD56dim CD16+ CD3- dNK細胞(P<0.05)，病例組與正常對照CD56bright CD16- CD3- dNK細胞所占比例無顯著差異(P>0.05)，CD56dim CD16+ CD3- dNK 細胞所占比例也無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論先兆子癇患者與正常孕婦孕晚期子宮蛻膜內(nèi)dNK細胞表型沒有明顯不同，均以CD56bright CD16- CD3-亞型為主。

【關(guān)鍵詞】子癇前期； 子宮蛻膜； 自然殺傷細胞； 細胞表型； 母-胎界面

【中圖分類號】R 714.24+5【文獻標志碼】A

收稿日期：( 2014-02-10； 編輯： 張文秀)

Study on phenotype of decidual NK cells in preeclampsia patientsJIANG Nina

(DepartmentofObstetrics,JiaozhouCentralHospitalofQingdao,Qingdao266300,Shandong,China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the phenotype of uterine decidual natural killer cells(dNK cells) in preeclampsia patients. Methods30 women with preeclampsia were selected as case group. 30 normal pregnant women were selected as normal control group. The decidual tissues were sampled immediately after caesarean section. The mononuclear cells were extracted from the tissues by means of mechanic grinding and gradient centrifugation. The technique of flow cytometry was used for dNK cell sorting and the expression of CD56 and CD16 on the surface of cells was also examined. ResultsIn case group and normal control group, the proportions of CD56bright CD16- CD3- dNK cells were significantly higher than those of CD56dim CD16+ CD3- dNK cells(P<0.05). Neither the CD56bright CD16- CD3- subtype nor the CD56dim CD16+CD3- subtype had statistical difference between case group and normal control group(P>0.05). ConclusionThe phenotypes of dNK cells from the women with preeclampsia and from healthy pregnant women are both dominated by CD56bright CD16- CD3- subtype, without significant difference.

【Key words】Preeclampsia; Uterine decidua; Natural killer cells; Cell phenotype; Maternal-feta linter face

子癇前期是孕婦妊娠期特有的嚴重并發(fā)癥之一。在我國人群中發(fā)病率高達9.4%，直接影響母兒結(jié)局，危害母嬰健康，但其發(fā)病原因和機制尚不清晰。研究表明，該病的發(fā)生與母體免疫系統(tǒng)功能混亂有關(guān)[1-2]。母-胎界面的局部免疫微環(huán)境在妊娠的發(fā)生和維持以及臨產(chǎn)的發(fā)動中發(fā)揮重要作用。子宮蛻膜自然殺傷細胞(decidual natural killer cells, dNK cells)是母-胎界面最主要的免疫細胞[3]，在局部發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，主要包括兩種表型：CD56brightCD16-CD3-和CD56dimCD16+CD3-，兩者的平衡是正常妊娠的重要因素，已知正常妊娠者體內(nèi)的dNK細胞以CD56brightCD16-CD3-亞型為主[4]。子癇前期患者的蛻膜局部免疫微環(huán)境變化可能導(dǎo)致免疫耐受失衡而影響妊娠，Wilczynski等[5]稱子癇前期患者dNK表型存在變化，CD56dimCD16+CD3-亞型增加，而周等[6]稱dNK細胞表型并未改變。顧及到母-胎界面在妊娠中各種因素，本研究主要對子癇前期患者孕晚期子宮蛻膜內(nèi)dNK細胞進行了表型研究。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年12月至2013年5月在我院住院的子癇前期患者30例作為病例組，所有患者無其他妊娠合并癥及并發(fā)癥，隨機選取同期在我院產(chǎn)前檢查正常的晚期妊娠婦女30例作為正常對照組。兩組孕婦無血緣關(guān)系，平均年齡、孕周、孕產(chǎn)次均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。所有受試者既往沒有高血壓及肝臟疾病史，沒有糖尿病等其他免疫性疾病史，沒有腎臟疾病、器官移植、免疫治療及輸血史，沒有傳染病病史，月經(jīng)規(guī)則，末次月經(jīng)清楚。正常晚期妊娠及子癇前期的診斷參照第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》[7]。

1.2主要試劑、儀器RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司，人淋巴細胞分離液(Ficoll)和雙抗(青霉素、鏈霉素)購自上海華精生物有限公司，熒光素標記的小鼠抗人單克隆抗體( CD3-PE-Cy5、CD16-FITC和CD56-PE) 購自BD Pharmigen 公司，小鼠IgG1- PE- Cy5、IgG1-FITC和IgG1- PE購自R&D 公司，苔盼藍購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，流式細胞檢測儀為BD FACE Calibur公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1標本采集和單細胞懸液制備在知情同意的情況下，所有研究對象施行剖宮產(chǎn)手術(shù)，胎盤、胎膜娩出后，立即用眼科剪剪取胎盤附著部位宮壁的蛻膜組織約5 g，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗所取蛻膜組織，以洗去組織中的血液、胎糞、胎脂等物質(zhì)，然后將其置于盛有RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含胎牛血清10%、青霉素100 U/L和鏈霉素100 mg/L)的平皿中，用眼科剪反復(fù)剪碎至直徑1 mm 左右，用研磨棒輕輕研磨，放在200目不銹鋼網(wǎng)上過濾，收集細胞懸液。將Ficoll 平鋪于15 mL無菌離心管中，再將收集的細胞懸液按照1:1的比例平鋪于Ficoll上(形成清楚的分界面)，4℃、2000 r/min離心15 min，然后吸取中間的云霧樣絮狀物層并置于另一支無菌離心管中。PBS洗滌2次(4℃、1500 r/min離心5 min)，最后1次離心棄上清后，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液輕輕吹打混合均勻，調(diào)整細胞濃度約為1×108/L，即得單細胞懸液。取少許細胞懸液，苔盼藍拒染法檢測細胞活力> 90%。

1.3.2dNK細胞表型檢測每份標本取2管蛻膜單細胞懸液各100 μL，分別標記為1號和2號，1號管中均加入單克隆抗體小鼠抗人CD3-PE-Cy5、CD16-FITC和CD56-PE各15 μL，2號管中均加入小鼠IgG1- PE- Cy5、IgG1-FITC和IgG1- PE各15 μL作為同型對照，充分混勻，4℃避光孵育30 min，1500 r/min 離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，每管內(nèi)加入200 μL PBS重懸細胞。用流式細胞儀進行檢測。

2結(jié)果

經(jīng)流式細胞技術(shù)分選，熒光抗體標記CD56表達陽性、CD3表達陰性(CD56+CD3-)的細胞為dNK細胞。根據(jù)dNK細胞表面CD56表達水平的高低及是否表達CD16，將其分為CD56brightCD16-CD3-dNK細胞和CD56dimCD16+CD3-dNK細胞。

2.1病例組和正常對照組中dNK細胞亞群的分布及比較病例組中子癇前期患者dNK細胞以CD56brightCD16-CD3-亞型為主，其數(shù)量明顯多于CD56dimCD16+CD3-亞型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；正常對照組中dNK細胞也以CD56brightCD16-CD3-亞型為主，其數(shù)量明顯多于CD56dimCD16+CD3-亞型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

Tab.1The comparison of CD56brightCD16-CD3-dNK cells and CD56dimCD16+CD3-dNK cells

組別dNK細胞亞型CD56brightCD16-CD3-CD56dimCD16+CD3-P病例組43.7±17.48.9±6.30.000正常對照組48.3±15.99.3±5.80.000

2.2病例組與正常對照組之間dNK細胞各亞型的比較分別對病例組與對照組之間的CD56brightCD16-CD3-dNK細胞和CD56dim CD16+ CD3- dNK細胞進行比較，兩者之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

Tab.2The comparison of dNK cell subtypes

dNK細胞免疫表型組別病例組正常對照組PCD56brightCD16-CD3-43.7±17.448.3±15.90.290CD56dimCD16+CD3-8.9±6.39.3±5.80.799

3討論

從免疫學(xué)角度看，妊娠這種特殊的生理現(xiàn)象類似于器官移植，但在正常情況下，胚胎作為半同種異體移植物卻不被母體子宮排斥，與復(fù)雜而精細的免疫學(xué)調(diào)節(jié)機制密切相關(guān)，尤其是子宮局部免疫微環(huán)境的調(diào)控。子宮蛻膜是最直接與胚胎接觸的母體組織，即母-胎界面。子宮蛻膜組織中含一定量的免疫細胞，如自然殺傷細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、少量T細胞和B細胞等，其中NK細胞的數(shù)量最多，其比例隨著妊娠的發(fā)展而改變，在早期妊娠中約占蛻膜淋巴細胞的50%～90%，晚期妊娠時約占30%～40%[8]，在妊娠期間發(fā)揮重要的免疫學(xué)作用[9]。NK細胞具有自然殺傷作用，屬于非特異性免疫，以非MHC (主要組織相容性復(fù)合體) 限制形式殺傷各種靶細胞。研究報道，在孕期激素作用下，出現(xiàn)大量dNK細胞[10]。CD56brightCD16-CD3-dNK細胞 和CD56dimCD16+CD3-dNK細胞在基因表達及功能上也存在很大差異。CD56brightCD16-CD3-dNK細胞是分泌型細胞，一方面通過產(chǎn)生各種細胞因子和血管源性分子等生物活性物質(zhì)參與妊娠的免疫耐受[11]、子宮螺旋動脈的構(gòu)建[12]以及絨毛外滋養(yǎng)細胞(EVT)的浸潤及胎盤的發(fā)育形成[13]，另一方面通過細胞表面表達抑制受體，傳遞抑制信號，抑制NK細胞的激活，保護胚胎免受母體免疫系統(tǒng)的排斥，進而利于妊娠的發(fā)生和維持[14]。CD56dimCD16+CD3-dNK細胞內(nèi)含有大量的穿孔素、顆粒酶等殺傷性物質(zhì)，主要發(fā)揮細胞毒性殺傷作用，通過直接釋放預(yù)存的殺傷性物質(zhì)或通過抗體依賴性細胞毒性作用(ADCC)來殺傷靶細胞[15]。正常妊娠與dNK細胞的免疫抑制作用有關(guān)，以對胚胎的營養(yǎng)作用為主，在保證胚胎生長發(fā)育中具有重要作用[16]。不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)、胚胎停止發(fā)育等妊娠早期并發(fā)癥與子宮蛻膜NK細胞表型和功能密切相關(guān)，一些產(chǎn)科常見的妊娠晚期并發(fā)癥如子癇前期、子癇、胎兒生長受限等，可能也與免疫異常有關(guān)[17]。本研究從子癇前期患者母-胎界面免疫出發(fā)，為從免疫學(xué)角度研究子癇前期的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

子癇前期的發(fā)病機制尚未明確。關(guān)于病理性妊娠的大量研究表明，子宮局部免疫微環(huán)境的異常是導(dǎo)致妊娠失敗的主要原因之一[18]，明確此處的微循環(huán)特點對認識疾病的發(fā)生機制及預(yù)防治療有著重要的意義。本實驗在對母-胎界面dNK細胞進行研究時發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者孕晚期dNK細胞的表型沒有發(fā)生明顯改變，與正常妊娠晚期一樣，以具有免疫抑制作用的亞群CD56brightCD16-CD3-dNK細胞為主，子癇前期患者與正常孕婦CD56brightCD16-CD3-dNK細胞和CD56dimCD16+CD3-dNK細胞所占比例均無明顯差異，這與周[19]等的報道相一致。但是，即使是同一表型的細胞，在功能上也不一定完全一致。dNK細胞表面表達殺傷細胞活化性受體(killer activating receptors, KARs)和殺傷細胞抑制性受體(killer inhibiting receptors, KIRs)兩種受體，其與相應(yīng)配體相互作用后，通過上調(diào)/下調(diào)dNK細胞的功能，從而產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。Hanna等[20]報道活化的dNK細胞能通過分泌NK細胞來源的生長因子和化學(xué)因子促進滋養(yǎng)細胞浸潤、蛻膜血管形成從而防止子癇前期的發(fā)生，而Hiby等[21]認為抑制dNK細胞可能增加子癇前期患病風(fēng)險。除此之外，dNK細胞本身的反應(yīng)性也會影響其生物學(xué)效應(yīng)。故我們推測子癇前期的發(fā)生可能是由CD56brightCD16-CD3-dNK細胞功能異常引起，有必要對dNK細胞功能進行進一步深入研究。

4結(jié)論

妊娠是一個極其復(fù)雜的生理過程，dNK細胞與正常妊娠的維持密切相關(guān)，在母-胎界面免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用，子癇前期患者與正常孕婦妊娠晚期dNK細胞的表型都是以CD56brightCD16-CD3-亞型為主，推測可能dNK細胞自身功能異常與本病發(fā)生有關(guān)。

【參考文獻】

[1]Boukerrou M, Bresson S, Collinet P,etal. Factors associated with uterine artery Doppler anomalies in patients with preeclampsia[J]. Hypertens Pregnancy, 2009, 28(2): 178-189.

[2]蔣萌, 林建華. 子癇前期及其高危因素對圍產(chǎn)兒結(jié)局的不良影響[J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展, 2013, 22(5): 360-363.

[3]王偉, 王景, 翁靜. 蛻膜自然殺傷細胞在人早孕期基蛻膜和壁蛻膜的分布比較[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2011, 32(2): 259-262.

[4]Saito S, Nakashima A, Myojo-Higuma S,etal. The balance between cytotoxic NK cells and regulatory NK cells in human pregnancy[J]. J Reprod Immunol, 2008, 77(1): 14-22.

[5]Wilczyński JR, Tchórzewski H, Banasik M,etal. Lymphocyte subset distribution and cytokine secretion in third trimester decidua in normal pregnancy and preeclampsia[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2003, 109(1): 8-15.

[6]周建軍, 胡婭莉, 郝莎, 等. 子癇前期患者母-胎界面子宮自然殺傷細胞免疫表型及輔助性T淋巴細胞1、2免疫狀態(tài)的研究[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2007, 42(4): 244- 248.

[7]樂杰. 婦產(chǎn)科學(xué)[M]. 第7版, 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2008: 92-94.

[8]Karimi K, Arck PC. Natural Killer cells: keepers of pregnancy in the turnstile of the environment[J]. Brain Behav Immun, 2010, 24(3): 339-347.

[9]Saito S, Shima T, Nakashima A,etal. Regulatory T cells and regulatory NK cells play essential roles for maintenance of pregnancy[J]. Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi, 2012, 35(5): 424-428.

[10] 黃榮云, 張羽, 趙洋, 等.NK 細胞與妊娠期免疫耐受的維持[J]. 吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報, 2013, 34(4): 283-286.

[11] Le Bouteiller P, Siewiera J,Casart Y,etal. The human decidual NK-cell response to virus infection: what can we learn from circulating NK lymphocytes? [J]. J Reprod Immunol, 2011, 88(2): 170-175.

[12] Manaster I, Mandelboim O. The unique properties of human NK cells in the uterine mucosa[J]. Placenta, 2008, 29(Suppl A): S60-S66.

[13] Hu Y, Dutz JP, MacCalman CD,etal. Decidual NK cells alter in vitro first trimester extravillous cytotrophoblast migration: a role for IFN-gamma[J]. J Immunol, 2006, 177(12): 8522-8530.

[14] 肖敏, 凌斌, 陳崢崢, 等. 早孕外周血及蛻膜中NK細胞表型及T淋巴細胞亞群的變化[J]. 細胞與分子免疫學(xué)雜志, 2008, 24(3): 285-287.

[15] Dambaeva SV, Durning M, Rozner AE,etal. Immunophenotype and cytokine profiles of rhesus monkey CD56bright and CD56dim decidual natural killer cells[J]. Biol Reprod, 2012, 86(1): 1-10.

[16] Laskarin G, Redzovic A, Rubesa Z,etal. Decidual natural killer cell tuning by autologous dendritic cells[J]. Am J Reprod Immunol, 2008, 59(5): 433-445.

[17] 曹霞, 王蓮蓮, 羅娜. 復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)育齡期婦女母-胎界面中細胞因子表達分析[J]. 細胞與分子免疫學(xué)雜志, 2011, 27(3): 311-312.

[18] 毛東偉, 楊東霞, 段志宇, 等. 先兆子癇胎盤的基因表達譜研究[ J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(9): 1806-1809.

[19] 周娟, 肖小敏.妊娠期高血壓疾病患者子宮蛻膜NK細胞表型分析[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(1): 183- 186.

[20] Hanna J, Goldman-Wohl D, Hamani Y,etal. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface[J]. Nat Med, 2006, 12(9): 1065-1074.

[21] Hiby SE, Walker JJ, O'shaughnessy KM,etal. Combinations of maternal KIR and fetal HLA-C genes influence the risk of preeclampsia and reproductive success[J]. J Exp Med, 2004, 200(8): 957-965.