利用SSR標(biāo)記快速鑒定西瓜雜交種純度

張佩倫 郭祿芹 胡倩梅 楊路明 馬長(zhǎng)生

摘要：為了快速高效地鑒定雜交種純度，建立完善的西瓜雜交種純度SSR分子標(biāo)記鑒定技術(shù)體系。利用30對(duì)雜合率高、多態(tài)性高的SSR引物對(duì)‘豫藝360‘豫藝黑小寶‘國(guó)豫二號(hào)和‘甜王這4份在河南省廣泛種植的西瓜雜交種父母本進(jìn)行篩選，篩選出7對(duì)條帶清晰、多態(tài)性較好的引物。通過(guò)PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增及凝膠電泳進(jìn)行純度分析，對(duì)4份雜交種的F₁樣本進(jìn)行鑒定，純度分別為91.1%、93.2%、92.6%、91.4%，將分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果相比對(duì)，兩者偏差52%，在允許范圍之內(nèi)，表現(xiàn)出高度一致。

關(guān)鍵詞：西瓜;SSR;分子標(biāo)記;純度鑒定

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)性狀鑒定方法（即田間鑒定法）[1]存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力，易受環(huán)境、氣候及人為因素的影響等一系列弊端。分子標(biāo)記從DNA水平上檢測(cè)個(gè)體或種群間基因組中存在的某種差異，通過(guò)PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增及凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)出個(gè)體間的差異，準(zhǔn)確區(qū)分出純合帶型和雜交帶型，從而快速高效地鑒定雜交種的純度。王吉明等[Z]總結(jié)出了系統(tǒng)性的鑒別方法，李超漢等[3]針對(duì)不同的西瓜雜交種進(jìn)行純度鑒定和特異性分析。但由于西瓜遺傳背景狹窄，不同品種之間的親緣關(guān)系較近，分子標(biāo)記多態(tài)性較低，會(huì)限制分子標(biāo)記在純度鑒定上的應(yīng)用。筆者利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，旨在找出適宜的SSR標(biāo)記鑒定‘豫藝360‘豫藝黑小寶‘國(guó)豫二號(hào)‘甜王這4份在河南普遍種植的西瓜雜交種純度，并通過(guò)田間形態(tài)學(xué)性狀鑒定進(jìn)行相互驗(yàn)證，進(jìn)而可替代田間形態(tài)學(xué)性狀檢測(cè)方法[4]，建立高效的SSR分子標(biāo)記鑒定雜交種純度的體系。

1 材料與方法

1.1 供試西瓜雜交種

選擇4份在河南省廣泛種植，在各種性狀上均具有代表性的優(yōu)質(zhì)西瓜商業(yè)雜交品種（表1），4份材料均由河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，分別為‘豫藝360‘豫藝黑小寶‘國(guó)豫二號(hào)和‘甜王。2017年5-8月在田間種植（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)扶溝蔬菜研究院試驗(yàn)基地）進(jìn)行形態(tài)學(xué)性狀鑒定試驗(yàn)，2017年9-12月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院分子實(shí)驗(yàn)室利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行雜交種的純度鑒定。

1.2 SSR分子標(biāo)記純度鑒定方法

1.2.1 西瓜雜交種催茅與育苗 取每份雜交種的F₁及其父母本種子，分別育苗。溫湯浸種10～15min，高錳酸鉀5000倍液浸泡4h，常溫浸泡4ho浸種后，將種子用濕毛巾包裹后置于培養(yǎng)箱中催芽，白晝時(shí)長(zhǎng)14h，溫度30℃，夜間時(shí)長(zhǎng)10h，溫度25℃，將種子放于吸水布上，并在種子上部覆蓋吸水紙進(jìn)行育苗。后期根據(jù)幼苗出苗情況除去子葉上部種皮，幼苗子葉展平后采樣[5]。

1.2.2 提取供試雜交種F₁及父母本DNA 利用孫利萍等[5]的堿裂解法快速提取雜交種F₁DNA，利用CTAB法提取父母本的DNA.

1.2.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè) PCR體系為模板DNA2μL，引物1μL，Master Mix 5μL，ddH₂O2μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min，94℃45s，58～68℃1min，6個(gè)循環(huán)，72℃1min，94℃30s，50～58℃1min，8個(gè)循環(huán)，72℃1min，94℃30s，50℃30s，20個(gè)循環(huán)，72℃1min，72℃7min，4℃保存。用30%（ω）聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳90min，使用銀染法進(jìn)行染色，分析電泳結(jié)果[6]。

1.3 田間形態(tài)學(xué)性狀鑒定方法

主要結(jié)合瓜胎和幼瓜果皮顏色2個(gè)形態(tài)指標(biāo)，在坐瓜期和幼瓜期進(jìn)行綜合鑒定，將田間種植的純度鑒定結(jié)果收集整理，與實(shí)驗(yàn)室的鑒定結(jié)果作比對(duì)[1]。

1.4 供試西瓜雜交種SSR分子標(biāo)記引物的篩選

從Zhu等[7]設(shè)計(jì)的480對(duì)西瓜SSR引物中隨機(jī)篩選出多態(tài)性高且雜合率高的30對(duì)引物用于本試驗(yàn)的純度鑒定，用4份西瓜雜交種的親本對(duì)這30對(duì)引物進(jìn)一步篩選（圖1），最后篩選出7對(duì)在4份雜交種中表現(xiàn)出較好多態(tài)性的引物（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記引物篩選結(jié)果

引物WMSSR09205適用品種較多，在‘豫藝360‘豫藝黑小寶和‘甜王3個(gè)雜交種均可以擴(kuò)增出雜交或互補(bǔ)帶型，可以鑒定雜交種的純度。而引物WMSSR05567只適用于‘國(guó)豫二號(hào)的純度鑒定，在其他品種的純度鑒定條帶中表現(xiàn)均無(wú)差異性。

2.2 SSR標(biāo)記對(duì)西瓜雜交種的純度鑒定

通過(guò)引物WMSSR29311對(duì)‘豫藝360雜交種的純度檢測(cè)（圖2），結(jié)果顯示在90個(gè)F₁單株中，有82個(gè)單株表型為父母本雜合帶型，另外8個(gè)單株為母本純合帶型，因此該批樣本的純度鑒定結(jié)果為91.1%;利用引物WMSSR13827對(duì)‘豫藝黑小寶雜交種進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在‘豫藝黑小寶的89個(gè)F₁單株中，有83個(gè)單株表型為父母本雜合帶型，6個(gè)單株為母本純合帶型，純度鑒定結(jié)果為93.2%;引物WMSSR09205對(duì)‘甜王雜交種純度檢測(cè)（圖3），結(jié)果顯示在93個(gè)F₁單株中，有85個(gè)單株表型為父母本雜合帶型，8個(gè)單株為母本純合帶型，純度為91.4%。

利用引物WMSSR05567對(duì)‘國(guó)豫二號(hào)進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果顯示在95個(gè)F₁單株中，有88個(gè)單株表型為父母本雜合帶型，7個(gè)單株為母本純合帶型，故純度為92.6%。

2.3 SSR標(biāo)記與形態(tài)學(xué)性狀純度鑒定結(jié)果比對(duì)

利用田間形態(tài)學(xué)性狀鑒定法進(jìn)行田間鑒定，將得到的數(shù)據(jù)統(tǒng)一收集整理，與SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比（表3）。

將田間形態(tài)學(xué)性狀純度鑒定與SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者的純度偏差均符合允許的誤差范圍≤2%。導(dǎo)致田間純度鑒定結(jié)果與SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果產(chǎn)生偏差的原因，可能是取樣過(guò)程中沒(méi)有做到完全隨機(jī)或苗期長(zhǎng)勢(shì)較弱的植株（通常為母本）死亡，從而導(dǎo)致田間純度鑒定結(jié)果高于SSR分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果。

3 討論

在利用分子標(biāo)記對(duì)西瓜雜交種進(jìn)行純度鑒定中，首先面臨的是引物篩選問(wèn)題，需要找到可以將親本與雜交一代鑒別開(kāi)來(lái)、滿足西瓜純度鑒定的雜合率高和多態(tài)性高的核心引物。本研究中篩選出的引物在這4份西瓜雜交種中均表現(xiàn)良好，篩選出的特異性條帶清晰，便于識(shí)別，方便對(duì)西瓜雜交種純度進(jìn)行分析。蔣莉莉等[8]也通過(guò)試驗(yàn)證明SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行室內(nèi)鑒定的可行性，但篩選出的引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小比較接近，不利于多重PCR的擴(kuò)增。劉子記等[9]則利用兩對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小相差100bp的兩對(duì)引物進(jìn)行多重PCR試驗(yàn)，證明其可行性，可以顯著提高檢測(cè)效率。而在本研究中除WMS-SR05567擴(kuò)增產(chǎn)物在162bp，其他引物擴(kuò)增產(chǎn)物均在210～270bp之間，下一步應(yīng)篩選更多引物進(jìn)行多重PCR試驗(yàn)。多重PCR技術(shù)高效、快捷且具有高度特異敏感性，可以同時(shí)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)的變異情況進(jìn)行檢測(cè)，有利于加快純度鑒定進(jìn)程，建立標(biāo)準(zhǔn)化的鑒定程序。

對(duì)于因堿裂解法提取的DNA濃度較低、造成條帶較弱或缺失的樣本，應(yīng)使用CTAB法提取高質(zhì)量的DNA用于PCR的擴(kuò)增。也可以增加電泳時(shí)的上樣量，以便獲得更加清晰、容易識(shí)別的條帶。同時(shí)，點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)注意經(jīng)常更換槍頭，避免樣本間的串樣和污染，影響電泳條帶的顯示結(jié)果。

本研究中每份西瓜雜交種都篩選出了多態(tài)性較好的引物，在檢測(cè)自交苗的同時(shí)能將摻雜其中的其他品種植株鑒別開(kāi)來(lái)。這些引物可以提高檢測(cè)效率，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，為今后形成SSR分子標(biāo)記應(yīng)用于西瓜雜交純度鑒定的技術(shù)規(guī)程奠定研究基礎(chǔ)。同時(shí)，西瓜SSR分子標(biāo)記、西瓜表型的多樣性分析[10]、西瓜種群分布的聚類分析[11]、抗病品種的選育[12]、遺傳圖譜的構(gòu)建和相關(guān)性狀的分析[13]等一系列研究工作，都對(duì)西瓜的產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到了一定的推動(dòng)作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合4份在河南省廣泛種植的西瓜雜交種作為供試樣本，篩選出多態(tài)性較好的7對(duì)引物，適用于這4份西瓜雜交種。這些引物可以將西瓜雜交種之中的自交苗以及其他品種的異形株鑒別開(kāi)來(lái)。其中引物WMSSR09205在‘豫藝360‘豫藝黑小寶‘甜王這3份西瓜雜交種樣本中均具有良好的多態(tài)性，可作為鑒別這3個(gè)西瓜雜交種純度的優(yōu)質(zhì)引物。通過(guò)利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行西瓜雜交種的純度鑒定，與田間形態(tài)學(xué)性狀鑒定結(jié)果比對(duì)，對(duì)兩者結(jié)果進(jìn)行顯著分析，兩者的純度偏差均符合允許的誤差范圍≤2%，證明SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)西瓜雜交種純度的方法可以替代田間形態(tài)學(xué)性狀鑒定法。該技術(shù)可避免在雜交種純度鑒定中傳統(tǒng)田間形態(tài)學(xué)性狀鑒定法的繁瑣和不穩(wěn)定，減少勞動(dòng)量，消除人為主觀判斷對(duì)鑒定結(jié)果的影響，準(zhǔn)確、快捷、科學(xué)的鑒定出雜交種純度，具有更高的可信度。

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