HPLC法測定葡萄酒中胭脂紅含量的不確定度分析

金桂花 劉 匯 張 琳

（延邊州食品藥品檢驗所，吉林 延吉 133000）

胭脂紅（英文名：PONCEAU 4R），化學式：C20H11N2Na2O10S3，又名食用赤色102號（日本）、使用紅色7號、麗春紅4R、大紅、亮猩紅，為水溶液偶氮類著色劑。胭脂紅是目前我國使用最廣泛、用量最大的一種單偶氮類人工合成色素。因近年來，有報道指出，胭脂紅與歐盟標準禁用的蘇丹紅I 同屬于偶氮類色素，偶氮化合物在體內(nèi)可代謝生成致突變原前體－－芳香胺類化合物。我國規(guī)定的適用范圍和使用量均和莧菜紅相同。測量不確定度，可以檢測、校準、評估數(shù)據(jù)，它是一種能夠合理賦予測量對象的分析性，建立測量對象分析因素與因素之間關聯(lián)性的分析方法[1-2]，這種方法的應用機制為測量不確定度評定能給出測量結果的置信度和置信區(qū)間，不僅對于測量結果的評價具有重要作用，還可以通過對每個不確定度分量大小的分析，明確檢測過程中影響不確定度因素的主次。將HPLC法應用在葡萄酒的胭脂紅檢測中的原因，是因為胭脂紅與其他合成色素著著關聯(lián)性，如它能調(diào)配出類似于紫葡萄色或其他偶氮類合成著色劑，通過分析色譜，了解色譜檢測結果的關聯(lián)性，可以分析出葡萄酒中是否含有胭脂紅合成色素[3]。本文對高效液相色譜法測定葡萄酒中胭脂紅含量的測量不確定度進行評定，通過實驗的方法找出該方法中影響測量結果不確定度的主要因素，說明因素之間的主要觀聯(lián)與關聯(lián)結果反映出的檢測結果分析。

1 實驗部分

1.1 儀器。BT125D型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LDZ5-2型離心機：北京醫(yī)用離心機廠；Waters-e2695型高效液相色譜儀：美國沃特斯公司。

1.2 試劑。胭脂紅標準溶液：0.5 mg/mL，批號：12001，購于中國計量科學研究院；甲醇色譜醇；乙酸銨分析純；水均為去離子水。

1.3 HPLC實驗條件及系統(tǒng)適用性。色譜柱：依利特C18（4.6 mm×250 mm、10 μm）；檢測器：紫外檢測器；波長：254 nm；柱溫：28 ℃；流速：1.0 mL/min；流動相：甲醇-乙酸銨溶液（0.02 mol/L，pH=4）梯度洗脫。見表1。

表1 HPLC實驗條件及系統(tǒng)適用性

1.4 測定方法。標準溶液的制備：精密吸取胭脂紅標準溶液1 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，制成每1 mL含胭脂紅10 μg/mL的溶液。

供試品溶液的制備：精密吸取混合均勻的供試品5 mL，置離心管中，稱定重量，于2500轉/分鐘，離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

測定：分別精密吸取標準溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，根據(jù)保留時間定性，外表峰面積法定量。

2 結 果

2.1 不確定度數(shù)學模型

P：樣品中胭脂紅的含量（mg/kg）；Cs：胭脂紅標準品濃度0.5 mg/mL；Ax：供試品峰面積；As：標準品峰面積；Wx：供試品質量 g；Vx進、Vs進：供試品與標準品進樣量 μL。

2.2 不確定度來源分析及分量計算

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 取樣（樣品的均勻性）：樣品均勻，忽略不計。

2.1.2 稱重過程。BT125D型電子天平：感量為萬分之一，a=±0.1 mg；天平校準：U1（m樣/對）= a／k=0.05774 mg（服從矩形分布；天平重復：U2（m樣／對）=0.05 mg （公式：0.5×最后一位有效數(shù)字，萬分之一天平：0.1 mg）；天平引起的合成不確定天平引起相對不確定度：Urel

2.1.3 吸取過程：5 mL移液管引入的不確定度：容量允差，服從矩形分布：K＝√3 ：u1（V5）=a/K＝0.00866 mL；溫度引起的不確定度：u2（V5）=a/K ＝0.00306 mL；合成不確定度：U（V5）=相對不確定度：U rel×100%＝0.187%；供試品溶液制備過程引入的不確定度：u rel （P樣）=0.187%

2.2 標準品溶液配制

2.2.1 標準品的純度：說明書未提供不確定度，在此不參加計算。

2.2.2 溶解稀釋過程：1 mL移液管引入：合成不確定度：U（VX）相對不確定度：U rel （V1）容量瓶引入：合成不確定度：相對不確定度：Urel因此標準品溶液配制過程引入的不確定度：u rel （P對）= = 0.417%。

2.3 供試品和標準溶液峰面積引入的不確定度：U rel （A樣）= U rel（A對）= 0.577%。

2.4 液相色譜儀引入的不確定度：U（儀）= 0.0404%。

2.5 結果的重復測定：測量結果相對不確定度：u rel （P平均）=0.340%；合成相對不確定度：u rel （P）=0.996%；合成標準不確定度：u （P）=P平均×u rel （P）=10.5×0.996% = 0.105 mg/kg；擴展不確定度：U=k u （P）=2×0.105 =0.21≈0.2 mg/kg （k=2）；報告結果：供試品中胭脂紅的含量： P=（10.5±0.2）mg/kg （k=2）。

3 探 討

當前國家規(guī)定不允許在葡萄酒中添加胭脂紅合成色素，為了了解葡萄酒質量是否達到國家制訂的標準，進行胭脂紅不確定分析有非常重要的意義。HPLC法是一種提取方法軟件簡便、檢測時受到干擾的因素少、檢測成本投入不高的技術方法。對HPLC法測定葡萄酒中胭脂紅含量的不確定度分析技術進行分析。HPLC法測定的內(nèi)容包括應用不確定度分析分量的來源、分量對結果影響的程度、不確定度對檢測方法的影響、對其他拓展因素的影響這項項內(nèi)容。通過分項這四項結果，可以了解葡萄酒中胭脂紅的含量。評估脂胭紅含量的參數(shù)為置信概念、不確定度這兩項，而不確定度包含標準溶液濃度、標準曲線線性擬和、重復測定、樣品制備這四項，它們對不確定度的貢獻為依次為降序排列。影響結果的主要因素重復測定因素，在99.6%的置信概率下得到其擴展不確定度為0.2 mg/ kg。