芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心梗后心力衰竭大鼠脂質(zhì)代謝的影響及作用機(jī)制分析

王亞紅

（河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002）

慢性心力衰竭是臨床常見(jiàn)心血管疾病，近年來(lái)發(fā)病率逐漸上升[1]。目前尚未完全明確發(fā)病機(jī)制，有研究者指出，心肌病理重構(gòu)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂、水鈉代謝障礙等均參與心力衰竭的發(fā)病[2-3]。Wang JC等[4]研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭患者常伴脂質(zhì)代謝紊亂，脂肪酸利用率降低，導(dǎo)致心臟脂質(zhì)堆積，造成心肌缺氧，引起心肌細(xì)胞凋亡，增加脂毒性心臟病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，脂質(zhì)堆積、脂代謝紊亂可引起血管緊張素水平上調(diào)，激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，加劇心衰[5]。中醫(yī)將心力衰竭歸于“水腫”“心痹”“心悸”等范疇，病位在心，本虛標(biāo)實(shí)，癥見(jiàn)氣短乏力、心悸不安，氣血虧虛、心脈痹阻，治療需以益氣固脫、溫陽(yáng)補(bǔ)氣為主。芪藶強(qiáng)心膠囊系中成藥制劑，具有利水消腫、活血通路、益氣溫陽(yáng)等功效，目前已被證實(shí)可改善心衰患者心功能，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌激素及水液代謝[6]。但對(duì)心力衰竭患者脂質(zhì)代謝的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬建立心衰大鼠模型，旨在探討芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心梗后心力衰竭大鼠脂質(zhì)代謝的影響及作用機(jī)制，報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK(滬)2003-0003），5～8周齡，體質(zhì)量200～220 g，平均體質(zhì)量（210.5±3.4）g，自由攝食飲水，室溫23℃，濕度50 %～60 %，保持空氣流通，12 h交替光線照射。

1.2 主要藥物、試劑與儀器

鹽酸貝那普利片（深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司），芪藶強(qiáng)心膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司），游離脂肪酸（FFA）試劑盒（北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司），3-硝基酪氨酸（3-NT）、8-異前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）酶聯(lián)免疫試劑盒（購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司），n-3、n-6系多不飽和脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Nu-chek公司），蛋白定量試劑盒（美國(guó)Pierce公司），Agilent 7890A型氣相色譜儀、Version B.06.00數(shù)據(jù)處理軟件（均購(gòu)自美國(guó)Agilent公司），Eppendorf微量離心機(jī)、連續(xù)加樣器、離心管（均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司），MYLAB Five動(dòng)物超聲診斷系統(tǒng)（意大利百勝公司），AU5800型全自動(dòng)生化分析儀（購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司），DYZ-22A型雙恒定時(shí)電泳儀（北京六一儀器廠），UVP凝膠掃描系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）。

1.3 分組及建模

60只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、貝那普利組、芪藶強(qiáng)心組，各15只，除空白對(duì)照組外，均參照文獻(xiàn)[7]采用結(jié)扎冠脈左前降支法建立心肌梗死大鼠模型，心電圖顯示T波倒置或低平，ST段下降超過(guò)絕對(duì)值的0.1 mv視為造模成功，關(guān)閉胸腔。術(shù)后5周超聲檢測(cè)心功能，左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）低于45%視為心力衰竭模型造模成功。正常對(duì)照組不予任何處理。

1.4 給藥方法

芪藶強(qiáng)心組予芪藶強(qiáng)心膠囊藥液（50 g芪藶強(qiáng)心膠囊藥粉+500 mL 0.9 %生理鹽水，藥液濃度0.1 g/mL）灌胃，1 g/（kg·d）（臨床等效劑量2倍），給藥體積10 mL/（kg·d），每日清晨灌胃；貝那普利組以貝那普利藥液（50 mg貝那普利研成細(xì)粉+500 mL 0.9%生理鹽水，藥液濃度0.1 mg/mL）灌胃，10 mg/（kg·d），給藥體積10 mL/（kg·d），每日清晨灌胃；空白對(duì)照組、模型組采用等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)灌胃8 w。

1.5 取材

給藥8 w當(dāng)日禁食12 h后處死大鼠，采集頸動(dòng)脈血，抗凝血后混勻，離心后取上清，低溫保存；取心臟組織，生理鹽水沖洗，剪去心房及動(dòng)脈，留取左室心尖心肌組織，10%多聚甲醛溶液固定。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

①血漿指標(biāo)測(cè)定。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血漿FFA水平；采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定各組大鼠血漿3-NT、8-iso-PG2α水平，酶標(biāo)儀擬定標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)各孔OD值，獲取3-NT、8-iso-PGF2α濃度，均嚴(yán)格參照試劑使用說(shuō)明操作。②心肌組織相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。采用Western blot法測(cè)定心肌組織3-NT蛋白水平，取心肌組織100 mg，加細(xì)胞裂解液裂解5 min，離心20 min，取上清液，加等量上樣緩沖液混勻，水浴加熱5 min，配置分離膠，加入異丙醇，分離膠凝固完畢后，雙蒸水沖洗，加入濃縮膠，室溫放置0.5 h，凝固后轉(zhuǎn)入電泳槽，加電泳緩沖液，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育，洗膜，采用雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，將目標(biāo)蛋白/GAPDH灰度比值作為3-NT蛋白相對(duì)表達(dá)量；采用氣相色譜法測(cè)定心肌組織多不飽和脂肪酸（PUFAs）水平，n-3系PUFAs標(biāo)準(zhǔn)品包括C18∶3 n-3、C20∶5 n-3、C22∶5 n-3、C22∶6 n-3甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，n-6系PUFAs包括C18∶2 n-6、C20∶4 n-6、C22∶ 4 n-6甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，制成 10 μg/μl正庚烷溶液，甲酯化大鼠心肌組織，250 μL正庚烷溶液復(fù)溶，采用氣相色譜儀進(jìn)行分析，條件：聚乙二醇毛細(xì)管柱，柱溫：150 ℃，以每分鐘10 ℃升溫至190 ℃，維持58 min；后以每分鐘20 ℃升溫至230 ℃，維持15 min；保持氮?dú)饬髁砍^(guò)5 mL/min，空氣流量400 mL/min，氫氣流量30 mL/min，各組心肌組織均進(jìn)行色譜分離，復(fù)溶后測(cè)定樣品脂肪酸甲酯濃度，PUFAs =復(fù)溶后樣品脂肪酸甲酯濃度×復(fù)溶體積/（脂肪酸甲酯摩爾質(zhì)量×組織用量）。

1.7 觀察指標(biāo)

①比較各組大鼠8 w后血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA水平；②比較各組大鼠心肌組織3-NT蛋白表達(dá)水平；③比較各組大鼠心肌組織n-3系PUFAs水平；④比較各組大鼠心肌組織n-6系PUFAs水平；⑤分析心梗后心力衰竭大鼠血漿FFA水平與心肌組織n-3系、n-6系PUFAs的相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠8 w后血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA水平比較

模型組、貝那普利組、芪藶強(qiáng)心組血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA水平均高于空白對(duì)照組（P＜0.05），貝那普利組、芪藶強(qiáng)心組血漿上述指標(biāo)水平低于模型組（P＜0.05），芪藶強(qiáng)心組上述指標(biāo)低于貝那普利組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠心肌組織3-NT蛋白表達(dá)水平比較

模型組、貝那普利組、芪藶強(qiáng)心組心肌組織3-NT蛋白表達(dá)水平高于空白對(duì)照組（P＜0.05），貝那普利組、芪藶強(qiáng)心組心肌組織3-NT蛋白表達(dá)水平低于模型組（P＜0.05），芪藶強(qiáng)心組心肌組織3-NT蛋白表達(dá)水平低于貝那普利組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠心肌組織n-3系PUFAs水平比較

模型組、貝那普利組、芪藶強(qiáng)心組心肌組織n-3系PUFAs水平均低于空白對(duì)照組（P＜0.05），貝那普利組、芪藶強(qiáng)心組心肌組織n-3系PUFAs高于模型組（P＜0.05），芪藶強(qiáng)心組心肌組織n-3系PUFAs水平高于貝那普利組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 各組大鼠心肌組織n-6系PUFAs水平比較

模型組、貝那普利組、芪藶強(qiáng)心組心肌組織n-6系PUFAs水平高于空白對(duì)照組（P＜0.05），貝那普利組、芪藶強(qiáng)心組心肌組織n-6系PUFAs低于模型組（P＜0.05），芪藶強(qiáng)心組心肌組織n-6系PUFAs水平低于貝那普利組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 心梗后心力衰竭大鼠血漿FFA水平與心肌組織n-3系、n-6系PUFAs相關(guān)性

心梗后心力衰竭大鼠血漿FFA水平與C18∶3 n-3、C22∶5 n-3呈負(fù)相關(guān)（r=-0.571、-0682，P＜0.05），與C18∶2 n-6、C20∶2 n-6、C22:4 n-6呈正相關(guān)（r=0.935、0.912、0.801，P＜ 0.05）。

表1 各組大鼠8 w后血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA水平比較

表2 各組大鼠心肌組織3-NT蛋白表達(dá)水平比較

表3 各組大鼠心肌組織n-3系PUFAs水平比較

表4 各組大鼠心肌組織n-6系PUFAs水平比較

3 討論

心力衰竭系各類心臟病終末階段，患者生存率低，預(yù)后差[8]。有學(xué)者表示，大多數(shù)心力衰竭患者常伴心肌組織脂質(zhì)堆積，脂肪酸利用率降低，膽固醇、甘油三酯合成增多[9]。脂肪酸為心肌組織重要能量底物，系構(gòu)成脂肪的基本單位，其消耗增多，合成降低，直接造成心臟能量代謝紊亂，引起心肌缺氧、缺血，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，誘發(fā)心力衰竭。同時(shí)心肌組織脂質(zhì)聚集可能造成血壓上升，提高交感神經(jīng)興奮性，加劇心功能衰竭。

PUFAs屬直鏈脂肪酸，參與血管生成、細(xì)胞增殖、有絲分裂、細(xì)胞凋亡及遷移等多類生理活性過(guò)程。馬柳一等[10]發(fā)現(xiàn)，n-3系、n-6系PUFAs在冠心病、高血壓、糖尿病等疾病發(fā)病過(guò)程中有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭大鼠模型血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA及心肌組織3-NT蛋白、n-6系PUFAs水平均較空白對(duì)照組高，心肌組織n-3系PUFAs水平低于空白對(duì)照組，提示心衰大鼠模型存在心肌細(xì)胞脂質(zhì)能量代謝障礙及脂肪酸堆積表現(xiàn)，顯著表現(xiàn)為血漿脂質(zhì)水平上調(diào)，心肌組織n-3系PUFAs水平下調(diào)，n-6系PUFAs濃度上升。另外，心衰大鼠血漿FFA水平與C18:3 n-3、C22:5 n-3呈負(fù)相關(guān)，與C18:2 n-6、C20:2 n-6、C22:4 n-6呈正相關(guān)，提示血漿脂肪酸水平與n-3系、n-6系PUFAs調(diào)節(jié)存在顯著關(guān)聯(lián)。

8-iso-PGF2α系F2α異構(gòu)體前列腺素家族成員，在體液內(nèi)表達(dá)水平恒定，是用于評(píng)定脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的常用指標(biāo)；3-NT則為酪氨酸殘基硝基化所生成的穩(wěn)定終末期產(chǎn)物，可增強(qiáng)硝化應(yīng)激反應(yīng)，加重心力衰竭程度，兩者表達(dá)上調(diào)提示心力衰竭大鼠機(jī)體存在明顯脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及硝化反應(yīng)。n-3系、n-6系均為PUFAs關(guān)鍵構(gòu)成部分，n-3系PUFAs攝入不足，n-6系PUFAs誘導(dǎo)類十二烷酸釋放增加，可促進(jìn)前列腺素分泌，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血液黏度增加，增加血管痙攣程度，促進(jìn)血栓形成，引起動(dòng)脈粥樣硬化；而當(dāng)n-3系PUFAs攝入過(guò)多時(shí)，可與n-6系PUFAs共同競(jìng)爭(zhēng)，降低n-6系PUFAs水平，因此必須重視心力衰竭脂質(zhì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)。

芪藶強(qiáng)心膠囊主要成分包括黃芪、人參、附子、丹參、玉竹、葶藶子、澤瀉、桂枝、香加皮、陳皮、紅花等，具有益氣溫陽(yáng)、強(qiáng)心通絡(luò)，活血通氣之功效，既往已被證實(shí)對(duì)血瘀絡(luò)阻疾病的治療效果肯定[11]。方中黃芪肥腠理、補(bǔ)陽(yáng)氣、溫分肉、達(dá)益衛(wèi)、利水消腫；附子入脾、腎、心經(jīng)，可回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)；人參大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫；芪藶利水益氣；丹參活血化瘀，清心通絡(luò)；玉竹滋陰補(bǔ)腎；桂枝通陽(yáng)化氣；配合澤瀉、香加皮為佐藥，可奏利水消腫之效。且現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，芪藶強(qiáng)心膠囊可逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，調(diào)節(jié)神經(jīng)及內(nèi)分泌[12]。本研究建立心衰大鼠模型，并應(yīng)用芪藶強(qiáng)心膠囊灌胃干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芪藶強(qiáng)心組灌胃8w血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA及心肌3-NT蛋白表達(dá)水平顯著低于貝那普利組及模型組，提示芪藶強(qiáng)心膠囊可抑制心衰大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及硝化應(yīng)激水平；同時(shí)灌胃8 w心衰大鼠心肌組織n-3系PUFAs水平高于貝那普利組及模型組，n-6系PUFAs水平低于貝那普利組及模型組，提示芪藶強(qiáng)心膠囊可調(diào)節(jié)心衰大鼠脂肪酸構(gòu)成，改善脂肪酸能量代謝。

綜上，心梗后心力衰竭模型大鼠存在明顯脂質(zhì)代謝紊亂表現(xiàn)，呈顯著脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及硝化應(yīng)激反應(yīng)，伴心肌PUFAs結(jié)構(gòu)紊亂，轉(zhuǎn)運(yùn)、利用率降低。芪藶強(qiáng)心膠囊可下調(diào)血漿3-NT、FFA、8-iso-PGF2α、心肌組織n-6系PUFAs水平，增加n-3系PUFAs水平，提高脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)及利用率，改善心肌能量代謝紊亂。