QuEChERS-UPLC-MRM-IDA-EPI法測定巴比妥類藥物的臨床監(jiān)測

涂鳳蓮，熊周芳，汪元符

（1. 新建區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，江西 南昌 330100；2. 南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330038）

巴比妥類藥物是一組巴比妥酸的衍生物，能夠抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)而起到鎮(zhèn)靜的作用。還可增強γ-氨基丁酸（GABA）的作用，有效延長氯離子通道的開放時間，使細胞過度除極；在高濃度時，可以在沒有GABA存在的情況下直接作用于GABA受體。巴比妥類藥物主要在肝臟中代謝，部分藥物未被轉(zhuǎn)化可直接從腎臟隨尿液排出。巴比妥類藥物是使用最早最廣泛的鎮(zhèn)靜催眠藥物，大劑量使用可麻痹延腦呼吸中樞，進而抑制呼吸導致死亡。而且，此類藥物還具有依賴性和成癮性，同時治療濃度窗相對較窄，很容易因為攝入過量而致死（曾被用于死刑注射，也常被自殺者所采用）。因此，巴比妥類藥物的合理使用、用藥監(jiān)護顯得尤為重要。通過文獻檢索[1-9]：以全血、尿液及其他（動物飼料、保健食品）基質(zhì)為檢材，己建立一系列巴比妥類藥物檢測方法，樣品前處理一般采用液-液分配萃?。ㄒ砸颐褳槿軇┗蛐≈滔噍腿。⊿PE），儀器方法有液相色譜法、毛細管電泳法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS/MS）法、離子遷移譜法等。本文以全血、尿液、唾液為檢材，采用QuEChERS[原理與高效液相色譜（HPLC）和SPE相似，都是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達到除雜凈化的目的]提取方法處理生物樣本，結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS），建立了QuEChERS-超高效液相色譜（UPLC）-多重反應監(jiān)測（MRM）-條件觸發(fā)（IDA Criteria）-增強子離子掃描（EPI）的檢測方法，可同時定性與定量測定巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥等巴比妥類藥物，為臨床監(jiān)測提供依據(jù)。

1 儀器、試劑與材料

AB Sciex 4000 Qtrap質(zhì)譜儀，ekspert ultraLC100超高效液相色譜儀，METTLER TOLEDO XS105電子分析天平，WH-3微型旋渦混合儀，Hettich Rotina 380R 1706型冷凍離心機，Reeko30位自動氮吹儀，Büchi Syncore 12位平行蒸發(fā)儀，KQ-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器，Thermo連續(xù)可調(diào)式精密移液器（20 μL～200 μL及 100 μL ～ 1000 μL），Millipore超純水系統(tǒng)。

試劑：乙腈（色譜純，Merck），甲酸銨（優(yōu)級純，阿拉?。?，甲酸（優(yōu)級純，阿拉?。?，無水硫酸鎂（優(yōu)級純，阿拉?。?，無水醋酸鈉（優(yōu)級純，阿拉?。瑹o水硫酸鈉（優(yōu)級純，阿拉?。珻18（粒度約80 μm，Agela），PSA（粒度約 60 μm，Agela），GC（粒度約 70 μm，Agela）。

標準物質(zhì)：巴比妥（CAS：57-44-3，批號：171220），苯巴比妥（CAS：50-06-6，批號：171222），異戊巴比妥（CAS：57-43-2，批號：171221），均來源于中國食品藥品檢定研究院。

檢材樣品：全血（外周血）、尿液與唾液，方法建立采用來源于健康人體的樣本，并監(jiān)測了近兩年來9例患者樣本，患者年齡31～65歲，病情及診斷為失眠或癲癇，給藥苯巴比妥，病例號：01463、12762、13497、26759、32079、91210、92568、92569、92581，對應編號為①～⑨，于給藥后1 h采樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 超高效液相色譜分析條件

分析柱：Waters Atlantis T3 C18，100 mm×2.1 mm，3 μm。柱溫：40 ℃。流速：0.2 mL/min。進樣量：5 μL。流動相：A為含0.1 %甲酸的5 mmol/L甲酸銨水溶液，B為乙腈。按表1進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源（ESI）：負離子模式（ESI-）。掃描模式：多重反應監(jiān)測（MRM）-條件觸發(fā)（IDA Criteria）-增強子離子掃描（EPI）。掃描范圍：50 Da～650 Da。氣簾氣壓力：30 Pa。碰撞氣密度：中。電離噴霧電壓：-4 500 V。離子源溫度：500℃。霧化氣壓力：60 Pa。輔助氣壓力：55 Pa。界面加熱狀態(tài)：開啟。離子對選擇見表2。

2.3 標準品溶液的配制

取巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥標準品各約10 mg，精密稱定，以乙腈制成每1 mL中各含1 mg的溶液作為混合標準品儲備液，再以乙腈稀釋制成每1 mL中各含10 μg的溶液作為混合標準品使用液。取混合標準品使用液以含0.1 %甲酸的5 mmol/L甲酸銨水溶液按一定比例稀釋，得到各含0.5，1，2，5，10，25，50，100，200 ng/mL的標準系列工作液。

表2 質(zhì)譜分析

2.4 供試品溶液的制備

取新鮮檢材，以QuEChERS方式提取凈化。

提?。壕芰咳∪ㄍ庵苎?、尿液或唾液等不同樣品各200 μL置5 mL離心管中，加入1 mL超純水，渦旋30 s使分散均勻，加入150 mg無水硫酸鎂與50 mg無水醋酸鈉，渦旋30 s使分散，再加入2 mL含0.1 %甲酸的乙腈，渦旋3 min進行提取，然后在4℃以10000 r/min離心5 min，分取乙腈層，重復提取一次，合并2次的乙腈提取溶液置另一5 mL離心管中待凈化。凈化：加入50 mg無水硫酸鈉，100 mg C18，50 mg PSA與50 mg GC，渦旋5 min使充分分散達到凈化目的，其中C18可吸附磷酯類物質(zhì)，PSA可吸附脂肪酸類物質(zhì)，GC可吸附色素，然后在4℃以10 000 r/min離心5 min，分取乙腈溶液在45℃平行蒸發(fā)或氮吹至干，冷卻至室溫后精密加入200 μL含0.1 %甲酸的5 mmol/L甲酸銨水溶液復溶，超聲30 s，以 5000 r/min離心，取上清液以0.22 μm微孔濾膜濾至小插管內(nèi)，取續(xù)濾液測定。若檢樣中所測藥物化學成分濃度過高，可適當以流動相初始溶液稀釋至線性范圍內(nèi)，再行測定。

圖1 標準溶液、加標樣品及空白樣品100 ng/mL時各離子對提取色譜圖

加標樣品制備：精密量取200 μL樣品（全血），以10 μg/mL的混合標準品使用液為加標溶液，使加標樣品終濃度為5，50，100 ng/mL，與上述提取、凈化步驟一致進行制備。

2.5 巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥離子對提取色譜圖，見圖1。

2.6 定性確認

采用保留時間與對照品相一致，且提取的二級質(zhì)譜圖與標準品相一致，判為檢出。見圖2。

2.7 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察

取“2.3”項下的標準系列溶液按照“2.1”項下的色譜條件和“2.2”項下的質(zhì)譜條件進樣檢測。以所得峰面積為縱坐標，以標準系列溶液濃度（ng/mL）為橫坐標，進行線性擬合。以定性離子對和定量離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比均大于3時的濃度為檢出限。以定性離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比大于3，定量離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比大于10時的濃度為定量限。以在一定濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)大于0.99，為線性范圍。結(jié)果見表3。

2.8 精密度試驗

選用標準系列溶液中濃度為100 ng/mL的標準溶液，連續(xù)進樣6針，以提取的定量離子對質(zhì)譜圖峰面積計算。結(jié)果見表4。

圖2 標準溶液與加標樣品100 ng/mL時EPI二級質(zhì)譜圖比較

2.9 穩(wěn)定性試驗

選用標準系列溶液中濃度為100 ng/mL的標準溶液，在0，1，2，4，8，12，24 h分別進樣，以提取的定量離子對質(zhì)譜圖峰面積計算。結(jié)果見表5。

2.10 重復性試驗

選用同一批次的全血樣本，按“2.4”項下的方法制備6份平行樣品，加標濃度為100 ng/mL，按本法檢測巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥的含量。結(jié)果見表6。

表3 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察結(jié)果

表4 精密度試驗結(jié)果

表6 重復性試驗結(jié)果

表5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.11 回收率試驗

以同一批次的全血樣本，準確量取200 μL定量加入標準品，按“2.4”項的方法制備加標樣品，進行檢測，以3次平行結(jié)果的均值計算，高、中、低三個濃度的回收率均在88.0%～96.8%之間。見表7。

2.12 樣品測定結(jié)果

選擇了近2年9例患者樣本（經(jīng)本院倫理委員會批準），患者用藥均為苯巴比妥，巴比妥類藥物顯效時間一般在0.5～1 h左右，選擇給藥后1 h采樣進行檢測，結(jié)果見表8。

表7 加標回收試驗結(jié)果

表8 苯巴比妥監(jiān)測結(jié)果

3 討論

3.1 試品前處理

從相關(guān)文獻[1-9]來看，還沒有應用QuEChERS法用于巴比妥類藥物檢測的先例。本文采用了QuEChERS法處理生物樣本（全血、尿液、唾液），從方法學驗證結(jié)果來看能滿足液質(zhì)聯(lián)用需要。本法簡單、便利、快捷，實用性強。

3.2 質(zhì)譜掃描模式

質(zhì)譜掃描模式采用MRM-IDA-EPI，既有較高的靈敏度，檢出限濃度達0.5 ng/mL，又能得到關(guān)聯(lián)的二級質(zhì)譜圖，對所測組分進行確證，避免了假陽性結(jié)果，具有明顯的優(yōu)勢。

3.3 方法設置

大多數(shù)情況下，內(nèi)標法結(jié)果優(yōu)于外標法，本處采用的是外標法，基于以下考量。從方法學證實的情況來看，此處外標法完全能夠滿足方法需要。從測試結(jié)果來分析，不同檢材樣品含量差異較大，高低相差幾十倍，如果采用內(nèi)標法，加入的內(nèi)標量應與其含量相近，很難采用一致的濃度加入內(nèi)標，需根據(jù)不同的樣品來設置內(nèi)標，在方法設置上有困難，可操作性差。內(nèi)標物質(zhì)的選擇和使用也存在困難，氘代同種化合物很難得到，成本高昂，作為一般性監(jiān)測，沒有必要使用。從測試結(jié)果含量來看，其濃度在線性范圍上限幾倍至幾十倍，可通過簡單的稀釋處理使樣品測試液濃度降低，在達到線性范圍要求的同時，有效地消除基質(zhì)效應，使測定結(jié)果更可靠。