哮喘兒童骨膜蛋白與氣道高反應(yīng)性的相關(guān)性研究

梁小輝，孟戰(zhàn)備，鄭紅玲

（洛陽(yáng)市婦女兒童醫(yī)療保健中心，河南 洛陽(yáng) 471000）

哮喘是一種以氣流阻塞為特征的復(fù)雜性臨床綜合征，與氣道高反應(yīng)性（airway hyperresponsiveness,AHR）和細(xì)胞炎癥有關(guān)[1-2]。血清標(biāo)志物在哮喘的診斷中具有重要的意義，并可鑒定哮喘表型。WoodruffPG等[3]利用骨膜蛋白作為T(mén)h2誘導(dǎo)氣道炎癥的生物標(biāo)志物，對(duì)氣道上皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行研究，結(jié)果顯示白細(xì)胞介素-13的響應(yīng)基因POSTN（該基因可以編碼骨膜蛋白）的表達(dá)水平可將哮喘患者分為高Th2表型和低Th2表型，前者對(duì)吸入性皮質(zhì)激素（ICS）反應(yīng)良好，但后者不敏感。另有研究顯示白細(xì)胞介素-13單克隆抗體可改善肺功能，尤其是對(duì)血清骨膜蛋白水平很高的患者[4]。生物標(biāo)志物分析表明，奧馬珠單抗可顯著降低高骨膜蛋白水平哮喘患者的發(fā)作頻率，其機(jī)制與呼出氣一氧化氮（FENO）分?jǐn)?shù)及血液中嗜酸性粒細(xì)胞水平相關(guān)[5]。因此，血清中骨膜蛋白是Th2誘導(dǎo)氣道炎癥、嗜酸性氣道早期炎癥和Th2靶向治療反應(yīng)的最理想生物標(biāo)志物[6]。氣道對(duì)外源性刺激的AHR是哮喘的重要特征[7]，既往研究表明Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-13可刺激肺成纖維細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生骨膜蛋白[3]。盡管具體作用機(jī)制尚無(wú)完全闡明，本文推測(cè)哮喘患者中，骨膜蛋白涉及哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性機(jī)制的調(diào)控。本研究探討哮喘兒童骨膜蛋白與AHR的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月—2016年6月本中心收治的哮喘兒童60例為哮喘組，根據(jù)《全球哮喘倡議》指南[8]，其中輕度間歇性哮喘16例，輕度持續(xù)性哮喘21例，中度哮喘23例。另外選擇健康兒童30例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[9]中兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：在過(guò)去6個(gè)月中出現(xiàn)哮喘急性發(fā)作且需全身糖皮質(zhì)激素控制者，在研究前4周胸片顯示有明顯的肺部疾病者。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，研究對(duì)象及監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 研究設(shè)計(jì)本研究分為4個(gè)階段：①準(zhǔn)備階段，試驗(yàn)期間所有患者均要求停止使用控制藥物；②第1次隨訪，采集兩組血液標(biāo)本，并測(cè)量呼出一氧化氮水平，進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)和肺、支氣管的呼吸量測(cè)定；③第2次隨訪，對(duì)患者進(jìn)行乙酰甲膽堿和吸入甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)；④第3次隨訪，內(nèi)容同第2次隨訪。兩次隨訪之間間隔至少1周。血清中骨膜蛋白水平測(cè)定之前，血標(biāo)本-80℃保存。

1.2.2 甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)記錄兩組吸入甘露醇干粉的一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1），作為基線值。當(dāng)出現(xiàn)基線狀態(tài)下FEV1變化值≥15%時(shí)，被認(rèn)為結(jié)果陽(yáng)性，即完成了甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)，或者當(dāng)出現(xiàn)最大累積劑量甘露醇（635 mg）也被認(rèn)為完成了甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)，其余為陰性結(jié)果。針對(duì)甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果，引起FEV1變化值≥15%的累計(jì)激發(fā)劑量（PD15劑量水平）是通過(guò)最后兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的對(duì)數(shù)線性插值計(jì)算出來(lái)的。甘露醇相應(yīng)的數(shù)值即PD15值。

1.2.3 乙酰甲膽堿激發(fā)試驗(yàn)受試者以日本產(chǎn)Chest Hl-501型肺功能儀測(cè)FEV13 次（相差＜5%），取平均值作為基線。取坐位、夾鼻，以Wright霧化器[美國(guó)產(chǎn)DEVILBISSAP-50空氣壓縮機(jī)驅(qū)動(dòng)，霧化量恒定在（0.13±0.02）mL/min，霧化顆粒直徑1.0～ 3.0 μ]，潮氣呼吸法吸入生理鹽水2 min后測(cè)FEV13次并與基礎(chǔ)值比較降低均不到10%，然后從低濃度開(kāi)始順次吸入各濃度的乙酰甲膽堿溶液(濃度為0.03～128 mg/mL,成倍遞增)，每一濃度吸入2分鐘，于吸入后第30 s、90 s各測(cè)FEV1，間隔5 min吸下一濃度，直至FEV1下降20%以上或最高濃度為止。以引起FEV1下降20%的乙酰甲膽堿濃度表示氣道反應(yīng)性（即PC20值）的高低。

1.2.4 呼出一氧化氮水平測(cè)定采用便攜式一氧化氮分析儀測(cè)量呼出一氧化氮，該分析儀可以提供以每十億分之一為度量單位的50 mL/s呼氣流速的測(cè)量。根據(jù)美國(guó)胸科協(xié)會(huì)的指導(dǎo)方針，用該裝置測(cè)定的結(jié)果在臨床上可接受，與固定分析儀提供的測(cè)量結(jié)果一致。

1.2.5 血清生物標(biāo)志物的測(cè)量?jī)山M采集空腹肘靜脈血5 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)量骨膜蛋白水平。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察并記錄兩組一般資料、外周血標(biāo)志物水平，包括骨膜蛋白、總免疫球蛋白（Ig）E水平、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白和呼出一氧化氮；采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）評(píng)價(jià)血清骨膜蛋白水平的診斷價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位間距）[M（Q1，Q3）]表示，采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman法；應(yīng)用ROC曲線分析血漿骨膜蛋白診斷哮喘的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）等資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。60名哮喘兒童中，乙酰甲膽堿支氣管激發(fā)試驗(yàn)（BPT）結(jié)果全部為陽(yáng)性，甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)陽(yáng)性40例，陰性20例。哮喘組FEV1、FEV1/FVC顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；哮喘組使用支氣管擴(kuò)張劑FEV1變化量大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組血清標(biāo)志物比較

哮喘組骨膜蛋白、總IgE水平、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白水平和呼出一氧化氮值高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 血清骨膜蛋白水平診斷哮喘的ROC曲線

ROC曲線結(jié)果顯示，當(dāng)血清骨膜蛋白為90 ng/mL作為最佳截?cái)嘀?，其診斷哮喘的AUC為0.65（95CI：0.50～0.75，P＜0.05），靈敏度為30%，特異度為95%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為49%，陰性預(yù)測(cè)值91%。見(jiàn)圖1。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)與骨膜蛋白水平的相關(guān)性分析

Spearman秩相關(guān)結(jié)果顯示，血清骨膜蛋白水平與嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、呼出一氧化氮水平呈正相關(guān)（r=0.332，P=0.017；r=0.383，P=0.002），與總 IgE 水平、嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白水平、FVC1、FEV1/FVC等無(wú)線性相關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

2.5 乙酰甲膽堿和甘露醇激發(fā)試驗(yàn)檢測(cè)骨膜蛋白與AHR的相關(guān)性

哮喘組血清骨膜蛋白水平與乙酰甲膽堿PC20值和甘露醇PD15值呈負(fù)相關(guān)（r=-0.293，P=0.038；r=-0.463，P=0.003）。調(diào)整了年齡、性別、遺傳性過(guò)敏癥、Log骨膜蛋白水平之后，血清骨膜蛋白水平的對(duì)數(shù)值與乙酰甲膽堿PC20對(duì)數(shù)值（生物標(biāo)志物水平增加2倍，乙酰甲膽堿PC20對(duì)數(shù)值下降1.229%）、甘露醇PD15對(duì)數(shù)值（生物標(biāo)志物水平增加2倍，甘露醇PD15對(duì)數(shù)值下降1.661%）顯著相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

圖1 血清骨膜蛋白水平診斷哮喘的ROC曲線

表1 兩組一般資料比較

表2 兩組血清標(biāo)志物比較

表3 檢測(cè)指標(biāo)與骨膜蛋白水平的相關(guān)性分析

表4 多元線性回歸分析乙酰甲膽堿和甘露醇激發(fā)試驗(yàn)檢測(cè)骨膜蛋白與AHR的相關(guān)性

3 討論

骨膜蛋白是一種分泌蛋白，在結(jié)締組織、骨、心肌、心瓣膜和皮膚中均可表達(dá)[10-11]。研究認(rèn)為骨膜蛋白通過(guò)與多種整合素相互作用，可參與細(xì)胞增殖和再生、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、纖維化和血管生成[12-13]。傳統(tǒng)上認(rèn)為哮喘是由于吸入性過(guò)敏原引起的Th2炎癥反應(yīng)所致，通常是以氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為常見(jiàn)特征[14]。導(dǎo)致氣道炎癥細(xì)胞持續(xù)存在、氣道結(jié)構(gòu)的改變、平滑肌功能的改變、哮喘患者AHR的機(jī)制尚不清晰?？赏ㄟ^(guò)采用直接刺激（如乙酰甲膽堿）或間接刺激（包括鍛煉、高滲鹽水及甘露醇）來(lái)進(jìn)行支氣管激發(fā)試驗(yàn)，進(jìn)而評(píng)估氣道對(duì)外源性刺激的AHR。骨膜是哮喘氣道新發(fā)現(xiàn)的一種成分的加厚基底膜，與哮喘纖維化有關(guān)，是氣道重塑的一個(gè)特征[15-17]。

本研究結(jié)果顯示，與健康兒童比較，哮喘兒童血清骨膜蛋白水平顯著升高，與文獻(xiàn)[3,18,19]研究結(jié)論一致。本研究中血清中骨膜蛋白水平與外周細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、呼出一氧化氮量顯著正相關(guān)，與文獻(xiàn)[20]報(bào)道相符。用乙酰甲膽堿導(dǎo)致支氣管收縮和甘露醇所致的特征不同，甘露醇試驗(yàn)通過(guò)1個(gè)或多個(gè)中間機(jī)制觸發(fā)氣道平滑肌收縮，如介質(zhì)，包括白三烯，前列腺素，組胺和炎性細(xì)胞，引起氣道炎癥；而乙酰膽堿直接作用于呼吸道平滑肌受體，不會(huì)引起炎癥的觸發(fā)收縮[21]。與乙酰膽堿試驗(yàn)相比，甘露醇試驗(yàn)用來(lái)識(shí)別當(dāng)前哮喘癥狀時(shí)，特異度更高，此外，甘露醇數(shù)據(jù)與氣道炎癥程度和疾病嚴(yán)重程度有較好的相關(guān)性[22-23]。本研究結(jié)果顯示，血清骨膜蛋白水平的對(duì)數(shù)值與乙酰甲膽堿PC20對(duì)數(shù)值（生物標(biāo)志物水平增加2倍，乙酰甲膽堿PC20對(duì)數(shù)值下降1.229%）、甘露醇PD15對(duì)數(shù)值（生物標(biāo)志物水平增加2倍，甘露醇PD15對(duì)數(shù)值下降1.661%）顯著相關(guān)。該試驗(yàn)結(jié)果測(cè)量使用乙酰甲膽堿和甘露醇所致AHR。

總之，哮喘兒童血清中骨膜蛋白水平與甘露醇試驗(yàn)和乙酰甲膽堿試驗(yàn)引發(fā)的AHR相關(guān)，外周血細(xì)胞中骨膜蛋白水平有望作為具有臨床應(yīng)用的生物標(biāo)志物。然而，本研究存在以下局限性：樣本量?。粺o(wú)法討論研究結(jié)果與哮喘控制不佳的關(guān)系；盡管本研究結(jié)果顯示哮喘患者群體和健康群體之間骨膜蛋白水平差異顯著，但骨膜蛋白水平的ROC曲線AUC僅為0.65。骨膜蛋白與其它生物標(biāo)志物聯(lián)合使用可能更有效，因此，有必要進(jìn)行大型隨機(jī)臨床試驗(yàn)證實(shí)。