miR—101調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制

王海江　宋麗霞　汪文斐　楊爭　夏照華　黃丕來　李國?！￡惻喾摇￡P(guān)彩艷

[摘要] 目的 探討miR-101在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用以及新的分子調(diào)控機(jī)制。 方法 將miR-101轉(zhuǎn)染到非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株，比較測量人類非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織的miR-101表達(dá)水平。采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-101在c-Fos的3′UTR潛在結(jié)合靶點(diǎn)，然后采用Western blot法和基因敲除方法檢測c-Fos的表達(dá)和功能。 結(jié)果 分析miR-101在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織表達(dá)，miR-101在非小細(xì)胞肺癌組織中低表達(dá)（0.00010±0.00002 vs 0.00021±0.00003，P=0.036），過表達(dá)miR-101抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。并且在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中敲除c-Fos和過表達(dá)miR-101有相似的效果。 結(jié)論 miR-101通過c-Fos靶點(diǎn)調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長，因此調(diào)控miR-101和c-Fos可以應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌潛在的分子治療。

[關(guān)鍵詞] 微小RNA-101；c-Fos；非小細(xì)胞肺癌；發(fā)病機(jī)制

[中圖分類號] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）24-0008-04

The pathogenesis of miR-101 in the regulation of non-small cell lung cancer7

WANG Haijiang SONG Lixia WANG Wenfei YANG Zheng XIA Zhaohua HUANG Pilai LI Guobao

CHEN Peifen GUAN Caiyan

Department of Thoracic Surgery， Shenzhen Third People's Hospital， Shenzhen 518112， China

[Abstract] Objective To investigate the role of miR-101 in the development and progression of non-small cell lung cancer and its new molecular regulation mechanism. Methods miR-101 was transfected into non-small cell lung cancer A549 cell line， and the expression level of miR-101 in human non-small cell lung cancer tissues and adjacent tissues was compared. The bioinformatics technique was used to predict the potential binding of miR-101 to the 3'UTR of c-Fos， and then the expression and function of c-Fos were detected by Western blot and gene knockout. Results The expression of miR-101 in non-small cell lung cancer tissues and adjacent tissues was analyzed. miR-101 was down-regulated in non-small cell lung cancer tissues （0.00010±0.00002 vs 0.00021±0.00003， P=0.036）. And overexpression of miR-101 was inhibited. Overexpression of miR-101 inhibited proliferation and induced apoptosis in non-small cell lung cancer A549 cells. And knocking out c-Fos and overexpressing miR-101 in non-small cell lung cancer cells had similar effects. Conclusion miR-101 regulates the growth of non-small cell lung cancer cells through c-Fos target， so the regulation of miR-101 and c-Fos can be applied to the potential molecular therapy of non-small cell lung cancer.

[Key words] MicroRNA-101； c-Fos； Non-small cell lung cancer； Pathogenesis

近年來肺癌的發(fā)病率及死亡率在全球均位居首位，如果從過去三十年算起，至今中國肺癌的發(fā)病率增長了465%。估計2017年中國肺癌發(fā)病率可上升至80萬例，而死亡人數(shù)達(dá)70萬例，肺癌已成為人類癌癥死亡的主要原因之一。此外，隨著人口老齡化和環(huán)境污染加劇，肺癌發(fā)病率具有逐年上升的趨勢。大部分肺癌是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），占肺癌總發(fā)病率的80%左右[1]。不幸的是，大部分的NSCLC患者在診斷時已經(jīng)是肺癌晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]，因此，NSCLC的治療效果一直很差，預(yù)后也不理想?？梢姡伟┤找娉蔀閲鴥?nèi)外醫(yī)學(xué)界面臨的一個嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，對肺癌（特別是NSCLC）發(fā)病機(jī)制和防治手段的探索非常迫切，因此，進(jìn)一步研究調(diào)控NSCLC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制具有重要意義。本研究對11例NSCLC組織及11例癌旁組織進(jìn)行微小RNA-101（miR-101）表達(dá)分析，探討miR-101在NSCLC臨床組織中的表達(dá)和功能。

1 材料與方法

1.1組織樣本和細(xì)胞系

選取我院自2016年11月～2017年10月胸外科手術(shù)切除的11例經(jīng)病理確診為NSCLC組織標(biāo)本和與之匹配的癌旁組織，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。本研究通過我院倫理委員會審查并批準(zhǔn)，所有實(shí)驗均按照相關(guān)的指南和規(guī)定完成。

NSCLC細(xì)胞株A549來源于ATCC（Manassas，VA，USA），從中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所獲得。用補(bǔ)充10%胎牛血清、2 μM谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 RNA提取和實(shí)時定量PCR（RT-PCR）

使用TRIzol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）按照產(chǎn)品說明書提取總RNA，并于-80 °C下保存?zhèn)溆?。檢測miRNA表達(dá)時，使用ABI miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）將約10 ng RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用U6基因作為內(nèi)參對照。檢測c-Fos表達(dá)時，根據(jù)產(chǎn)品說明書使用ABI反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems，USA），將每個樣品的1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用ABI SYBR Green Master試劑盒（Applied Biosystems， USA），按照說明書，對每個樣品進(jìn)行qRT-PCR分析，每個樣本一式三份，重復(fù)操作3次。以GAPDH作為內(nèi)參，所用引物序列為：上游：（1）C-Fos：5′-CGTGCCAGACATGGACCTAT-3′（正向）和5′-CGGGGTAGGTGAAGACGAAG-3′（反向）；下游：（2）GAPDH： 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′（正向）和5′-GCATGGACTGTGGTCATGAG-3′（反向）。

根據(jù)下列方法計算表達(dá)比：

MiR-101表達(dá)=2-CT值（miR-101）-CT值（U6）；

c-Fos表達(dá)=2-CT值（C-Fos）-CT值（GAPDH）。

1.3 miRNA mimics、c-Fos siRNA 和轉(zhuǎn)染

設(shè)計人miR-101雙鏈模擬物（miR-101）和陰性對照寡核苷酸雙鏈模擬物（miR-NC），并由廣州銳博生物科技有限公司（中國廣州）合成，c-Fos siRNA和對照siRNA寡核苷酸均購自Santa Cruz 公司（Santa Cruz，USA）。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行miRNA或siRNA轉(zhuǎn)染。

1.4 miRNA靶點(diǎn)預(yù)測

利用網(wǎng)站程序www.microRNA.org檢索可能的miRNA靶基因。

1.5 熒光素酶檢測

使用Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen，USA），按照產(chǎn)品說明書，將c-Fos 3UTR質(zhì)粒、海腎熒光素酶（Renilla luciferase）pPRL-TK載體（Promega，Madison，WI，USA）和miR-101 mimics/miR-NC mimics轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，48 h后測定雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)（Promega，USA）的發(fā)光強(qiáng)度。

1.6 細(xì)胞存活率分析

使用細(xì)胞計數(shù)KIT-8（CCK-8）分析試劑盒（Dojindo，Japan），根據(jù)產(chǎn)品說明書測定細(xì)胞存活率。

1.7 Caspase 3/7 活性

按照產(chǎn)品說明書（Pierce，USA）進(jìn)行Caspase 3/7活性分析。將 A549細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，在測試之前，用PBS洗滌細(xì)胞，然后將細(xì)胞與Caspase Glo 3/7試劑室溫下孵育1～2 h。使用微孔板光譜分析儀（Tecan Infinite M200，Switzerland）測定每個樣品的發(fā)光強(qiáng)度。

1.8 免疫印跡（Western blot）分析

提取總蛋白時，用1×PBS洗滌細(xì)胞，然后用RIPA緩沖液于冰上裂解細(xì)胞15 min，12000轉(zhuǎn)/min離心15 min，收集上清。按照實(shí)驗步驟，用不同抗體對提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡測試，使用的一抗為抗c-Fos（稀釋：1：2000）和抗GAPDH（1：10000抗體（Cell Signaling Technology，USA）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用百分比表示，采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA表達(dá)分析

本研究對11例非小細(xì)胞肺癌組織及11例癌旁組織進(jìn)行miRNA表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)miR-101在非小細(xì)胞肺癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)（0.00010±0.00002 vs 0.00021±0.00003，P=0.036）。

2.2 miR-101可調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長

本研究進(jìn)一步對miR-101生物學(xué)功能進(jìn)行探討。采用miR-101mimics增高非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞內(nèi)miR-101的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-101過表達(dá)后，A549細(xì)胞的增殖下降[（50±5）% vs（95±4）%，P=0.001]（表1）。此外，檢測細(xì)胞內(nèi)Caspase 3/7水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞內(nèi)Caspase 3/7水平增高（4000±500 vs 2800±510，P=0.010）（表1），提示A549細(xì)胞發(fā)生了凋亡。上述的結(jié)果表明：miR-101可調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的生長。

2.3 miR-101調(diào)控c-Fos的表達(dá)

為了進(jìn)一步探討miR-101的作用機(jī)制，本研究對其靶基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)c-Fos與miR-101存在結(jié)合靶點(diǎn)（圖1A）；熒光色素酶實(shí)驗顯示：miR-101 mimics可下調(diào)含結(jié)合位點(diǎn)的熒光質(zhì)粒的表達(dá)（圖1B）；此外，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染了miR-101 mimics后，c-Fos表達(dá)下調(diào)[（60±5）% vs（98±3）%，P=0.001]（圖1C）。這些結(jié)果提示：c-Fos是miR-101的靶基因。

2.4 c-Fos調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長

為進(jìn)一步探討c-Fos對非小細(xì)胞肺癌的影響，本研究采用c-Fos siRNA轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞增殖下降[（60±4）% vs （98±3）%，P=0.001]，Caspase 3/7表達(dá)增加[（3600±200） vs （2400±300），P=0.001]（表2），其結(jié)果與轉(zhuǎn)染miR-101一致。這提示：c-Fos可調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長，而c-fos可能是miR-101的功能基因。

2.5 c-Fos在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)

為進(jìn)一步探討c-Fos在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)，本研究對11例非小細(xì)胞肺癌組織及11例癌旁組織進(jìn)行mRNA表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)c-Fos呈高表達(dá)狀態(tài)（0.0050±0.0010 vs 0.0015±0.0005，P=0.0086），這與miR-101表達(dá)相反。進(jìn)一步驗證了上述c-Fos可能是miR-101功能基因的研究假設(shè)。

3 討論

miRNAs是一類非編碼單鏈微小分子RNA，是機(jī)體非常重要的調(diào)控分子[3]。miRNAs全長為18～25 bp，由基因組轉(zhuǎn)錄出具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄前體，再經(jīng)加工而成。miRNA通過和靶基因mRNA堿基配對形成引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控?；蚪M中，1/3以上的基因受miRNAs調(diào)控，一個miRNA可結(jié)合多個靶基因，而一個mRNA也可由多個miRNA共同調(diào)節(jié)，從而形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。

許多研究證實(shí)miRNAs是多種腫瘤發(fā)生過程中關(guān)鍵的調(diào)控分子[4-7]，在NSCLC中也發(fā)生miRNA表達(dá)改變。本研究證實(shí)了在NSCLC中miR-101和c-Fos的功能和相互作用。miR-101在NSCLC組織中的表達(dá)下調(diào)，這與以前的研究結(jié)果也是一致的[8]。過表達(dá)miR-101抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長，表明miR-101是NSCLC的腫瘤抑制因子[9，10]。這些均支持過度表達(dá)miR-101是NSCLC的一種潛在的基因治療，可能會使NSCLC患者治療獲益。

已有研究表明，肺癌組織細(xì)胞中，let-7、miR-15、miR-30、miR-126及miR-142等miRNA表達(dá)下調(diào)；而miR-21、miR-27、miR-93、miR-128、miR-155、miR-181、miR-214以及miR-301等在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)[5，11-13]。而這些miRNA亦調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖等生物學(xué)行為。miRNA的調(diào)節(jié)功能是通過直接作用靶基因與3'UTRs的相互結(jié)合而發(fā)揮作用。在這項研究中，螢光素酶實(shí)驗顯示：過表達(dá)miR-101可下調(diào)含結(jié)合位點(diǎn)的c-Fos熒光質(zhì)粒的表達(dá)，此外，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染了miR-101后，c-Fos表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果證實(shí)c-Fos是miR-101的靶基因。

c-Fos是一種重要的核內(nèi)癌基因，經(jīng)mRNA轉(zhuǎn)錄后的c-Fos蛋白，由380個氨基酸組成，其中含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，內(nèi)含二聚化結(jié)合區(qū)可與DNA中的5-TGAG/CTCA-3序列結(jié)合而轉(zhuǎn)錄激活。因此，它調(diào)節(jié)基因表達(dá)并參與多種生物過程。考慮到在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的激活中c-Fos的重要性，研究了c-Fos在miR-101介導(dǎo)的抗腫瘤中的作用。敲除c-Fos和miR-101過表達(dá)有類似的效果。 因此，這些結(jié)果表明miR-101在NSCLC A549細(xì)胞上的生物學(xué)功能至少部分是通過c-Fos靶基因完成。miR-101和c-Fos相互作用在其他腫瘤如骨肉瘤、膀胱癌、肝細(xì)胞癌和子宮內(nèi)膜癌中也已有報道[5，9，14]。隨后，c-Fos被確定為miR-101在這些腫瘤中的直接靶基因，并且在轉(zhuǎn)錄后受miR-101負(fù)調(diào)控，這與目前研究一致。

隨著EGFR突變/ALK融合/ROS1融合等肺癌系列致癌驅(qū)動基因的相繼確定，我國及國際上多項研究表明靶向治療藥物大大改善和延長攜帶相應(yīng)驅(qū)動基因的NSCLC患者的預(yù)后和生存[15-19]。本研究認(rèn)為miR-101通過直接抑制c-Fos的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，在一定程度上成為NSCLC抑制劑，因此，調(diào)控miR-101和c-Fos可以應(yīng)用于NSCLC潛在的分子治療。

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（收稿日期：2018-05-28）