加米霉素注射液對(duì)豬呼吸道常見(jiàn)病原菌的體外抗菌活性研究

康彥 鄧菲 王海

摘要：試驗(yàn)旨在研究加米霉素注射液對(duì)豬呼吸道常見(jiàn)病原菌的體外抗菌活性。采用微量肉湯稀釋法測(cè)定了加米霉素注射液及對(duì)照組替米考星注射液對(duì)豬呼吸道主要病原菌臨床分離株的最小抑菌濃度MIG。微量肉湯稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加米霉素對(duì)鏈球菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌等豬呼吸道疾病主要病原菌有良好的抗菌活性，其抗菌作用顯著優(yōu)于替米考星（ Ps0.05）。

關(guān)鍵詞：加米霉素;微量肉湯稀釋法;體外抑菌活性;副豬嗜血桿菌;多殺性巴氏桿菌;鏈球菌;傳染性胸膜肺炎

加米霉素（ Gamithromycin）是由法國(guó)梅里亞公司研發(fā)的一種新型動(dòng)物專(zhuān)用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)半合成抗生素，通過(guò)抑制細(xì)菌RNA依賴性蛋白合成而起抑菌和殺菌作用，對(duì)豬胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、多殺巴氏桿菌、鏈球菌等引起豬呼吸系統(tǒng)疾病的病原菌有很強(qiáng)的抗菌活性。

目前，在我國(guó)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物現(xiàn)行使用較為廣泛的是替米考星，該藥物用于預(yù)防或治療豬的呼吸系統(tǒng)疾病，通常采用拌料或飲水的給藥方式，達(dá)到預(yù)防或治療的效果需要多天重復(fù)給藥。雖然取得了良好的效果，但隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)，在很多地區(qū)出現(xiàn)了不同程度的耐藥性，隨著用量不斷增大，治療效果卻在逐步降低。加米霉素注射液與替米考星相比，具有單次注射給藥吸收迅速、生物利用度高、低殘留、安全性高、一次給藥持效時(shí)間長(zhǎng)等比較優(yōu)勢(shì)。在歐盟，美國(guó)、加拿大等國(guó)家已被用于預(yù)防和治療豬的呼吸系統(tǒng)疾病，并取得了良好的效果。

本文根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ CLSI）規(guī)定的抗菌藥物敏感性檢測(cè)方法要求，開(kāi)展了加米霉素注射液對(duì)豬呼吸系統(tǒng)疾病主要病原菌臨床分離株的體外抗菌活性試驗(yàn)研究，為指導(dǎo)臨床用藥和后續(xù)的新藥申報(bào)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品

加米霉素原料藥：含量99.61%，比號(hào)：GMM04，由華北制藥集團(tuán)動(dòng)物保健品有限責(zé)任公司公司提供;

替米考星原料藥：含量89.5%，批號(hào)：TMC1610151，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

1.1.2菌株

質(zhì)控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC29213，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理組保藏。

臨床分離菌株：豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌11株、副豬嗜血桿菌18株、豬多殺性巴氏桿菌株1 1株、豬鏈球菌18株，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.3培養(yǎng)基和試劑

培養(yǎng)基：MH肉湯、NB營(yíng)養(yǎng)肉湯、CAMHB肉湯等培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

其他試劑：脫纖維綿羊血購(gòu)自北京華奧科安科技有限公司;小牛血清購(gòu)自平瑞生物科技有限公司;革蘭氏染液購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。

1.1.4主要儀器和設(shè)備

超凈工作臺(tái)：Hfsafe-1200/C型，上海力申科學(xué)儀器有限公司;

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9162-1型，常州冠軍儀器制造有限公司;

冰箱：BCD-251WDBD型，青島海爾股份有限公司;

全自動(dòng)高壓滅菌鍋：HVE-50型，華粵行儀器有限公司;

電子天平：JD300-3型，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司;

生物顯微鏡：NIKON ElOO型，尼康儀器（中國(guó)）有限公司 可調(diào)微量移液器：20-200μL、100-1000μL規(guī)格，德國(guó)Eppendorf公司;

多道微量移液器：100-300μL規(guī)格，上海大龍?jiān)O(shè)備公司 紫外可見(jiàn)分光光度儀：Spectrum SP2100UV型，上海光譜儀器有限公司

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1藥品儲(chǔ)備液的制備

0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH6.0）：量取1 mol/L的磷酸二氫鈉2.6 mL，1 mol/L的磷酸氫二鈉17.4 mL，于100mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度。

加米霉素溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.129g加米霉素原料藥，在超聲波破碎的幫助下，用0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（ pH 6.0）溶解并定容至25mL，即配成5120μg/mL的儲(chǔ)備液，過(guò)濾除菌，分裝，-20℃保存。

替米考星溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.143g替米考星原料藥，用95%乙醇溶解并定容至25mL，即配成5120μg/mL的儲(chǔ)備液，過(guò)濾除菌，分裝，-20℃保存。

1.2.2菌液的制備

凍存的質(zhì)控菌株和試驗(yàn)菌株復(fù)蘇后，接種瓊脂平板，置37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取1個(gè)單菌落接種于MH培養(yǎng)液（鏈球菌用含有5%小牛血清的CAMHB肉湯），置37℃9呼育16 - 18h。獲得的菌液稀釋適當(dāng)倍數(shù)用紫外可見(jiàn)分光光度儀測(cè)定OD600值，MH肉湯調(diào)整菌液濃度使其OD600值落在0.08-0.1之間，此時(shí)菌液濃度約為1×108cfu/mL。之后用液體培養(yǎng)基按1：100稀釋作為試驗(yàn)菌液（1×106cfu/mL）。

1.2.3藥敏試驗(yàn)的操作

1）將加米霉素儲(chǔ)備液和替米考星儲(chǔ)備液用滅菌的MH肉湯進(jìn)行稀釋至需要濃度，待用;

2）無(wú)菌96孔板第1—11列加入滅菌MH肉湯100μL;

3）無(wú)菌96孔板第1列加入適宜濃度的藥液100μL，逐次倍比稀釋至1 1列;

4）無(wú)菌96孔板的第1—1 1列加入待測(cè)菌液100μL，每孔液體的終體積是200μL，每一行為一株菌，一株菌做兩行;

5） 第12列上4孔加入200μL/孔滅菌MH肉湯作為陰性對(duì)照，第12列下4孔加入200μL/孔菌液作為陽(yáng)性對(duì)照。

6）每種菌設(shè)置溶劑對(duì)照組，步驟同上。

7）藥物和菌液上樣完畢后，蓋好板蓋，置37℃溫箱培養(yǎng)18-22h，觀察結(jié)果。

1.2.4藥敏試驗(yàn)質(zhì)控

按美國(guó)CLSI規(guī)定：（1）質(zhì)控菌株應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)方法與臨床標(biāo)本種分離菌同步進(jìn)行藥敏試驗(yàn);（2）更換藥物或培養(yǎng)基時(shí)必須用相應(yīng)質(zhì)控菌株測(cè)試;（3）每批次試驗(yàn)均需同步進(jìn)行質(zhì)控菌的藥敏檢測(cè)。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel軟件處理，處理后用SPSS 20.0軟件進(jìn)行機(jī)率單位加權(quán)回歸法（Bliss法）計(jì)算MIC50和MIC90。

2.結(jié)果

MIC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1一表4，采用SPSS 20.0軟件分析表中數(shù)據(jù)可知，加米霉素對(duì)18株鏈球菌、18株副豬嗜血桿菌、1 1株多殺性巴氏桿菌、10株傳染性胸膜肺炎放線桿菌的vIC分別在0.125 - 1.OOμg/mL、0.125- 2.OOμg/mL、1.00 - 2.OOμg/mL、1.00 - 2.OOug/mL之間，MIC50和MIC90分別為0.26μg/mL和0.59μg/mL、0.26μg/mL和0.58μg/mL、1.30μg/mL和2.25μg/mL、0.68μg/mL和1.89μg/mL。替米考星對(duì)1 8株鏈球菌、18株副豬嗜血桿菌、11株多殺性巴氏桿菌、10株傳染性胸膜肺炎放線桿菌的MIC分別在1 .00-8.OOμg/mL、1.00--16.00μg/mL、8.00-64.OOμg/mL、4.00-32.OOμg/mL之間，MIC50和MIC90分別為2.01μg/mL和3.75μg/mL、3.08μg/mL和7.82μg/mL、13.94μg/mL和31.11μg/mL.7.44μg/mL和15.80μg/mL。

3討論

加米霉素（ Gamithromycin）是由法國(guó)梅里亞有限公司率先研制，其商品名為Zactran，2016年2月，歐盟批準(zhǔn)其用于治療由胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌引起的豬呼吸系統(tǒng)疾?。?SRD）。EMA報(bào)道了加米霉素對(duì)引起豬呼吸系統(tǒng)疾?。?SRD）的胸膜肺炎放線桿菌（ n=100）、多殺性巴氏桿菌（ n=100）、副豬嗜血桿菌（n=67）的MICso分別為0.25μg/mL、0.5μg/mL和1¨g/mL，對(duì)上述病原菌的MIC90分別為0.5μg/mL、1μg/mL、和2μg/mL，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果研究一致。試驗(yàn)表明加米霉素對(duì)副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌等豬呼吸道疾病主要病原菌有良好的抗菌活性，其抗菌作用顯著優(yōu)于替米考星（P≤0.05）。