Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化辣木葉蛋白超聲提取工藝研究

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(1. 齊齊哈爾大學(xué)，齊齊哈爾 161006；2. 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京 100191；3. 北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089)

1 引言

辣木(MoringaoleiferaLam)是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶植物[1]，其葉片營(yíng)養(yǎng)豐富，富含維生素、葉酸、泛酸、鈣、鐵、硒等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，尤其是其中的植物蛋白含量通?？蛇_(dá)15%，是酸奶的2倍[3,4]；且其蛋白質(zhì)中所含的必需氨基酸高于FAO/WHO/UNO對(duì)2～5歲兒童推薦的最適氨基酸攝取量[5]。因此，辣木葉是目前已知的最好的植物蛋白來源之一。辣木葉中蛋白質(zhì)常用的提取方法主要有超聲提取法[6-8]、堿提取法[9]、酶提取[10,11]、膜過濾法[12]，其中超聲提取法憑借操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、綠色環(huán)保的優(yōu)勢(shì)被廣泛使用。

響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方法(Response Surface Methodology，RSM)由George E. P. B.和Wilson K. B.于1951年提出[13]。它的核心是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn)，得到一定量的數(shù)據(jù)，通過多元二次回歸方程探討擬合因素和響應(yīng)變量之間的關(guān)系，獲得各因素的最優(yōu)參數(shù)，解決多變量問題[14]。響應(yīng)面法具有試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理、精密度高、預(yù)測(cè)性能好，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)[15]，得到了許多研究人員的關(guān)注和應(yīng)用，近年來已被廣泛應(yīng)用于精細(xì)化工[16,17]、機(jī)械加工[18]、農(nóng)業(yè)[19]等領(lǐng)域。

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了干燥辣木葉中蛋白質(zhì)的超聲提取工藝，通過單因素試驗(yàn)的方法考察了pH值、料液比、超聲功率、提取溫度和提取時(shí)間5個(gè)因素對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)的提取效率的影響；然后利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken模型對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，通過分析總結(jié)確定了辣木葉中蛋白質(zhì)的最佳提取工藝，該方法得率較高，具有較好的應(yīng)用前景。以此工藝條件對(duì)市售的76種辣木葉制品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取和分析。該方法為辣木葉在保健食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 材料和試劑

云南、廣東、廣西、福建、四川等不同產(chǎn)區(qū)隨機(jī)抽樣26個(gè)辣木葉樣品，19個(gè)辣木葉干粉樣品，31個(gè)辣木茶樣品，各取500 g至于50 ℃烘箱中，烘干后取出粉碎，過80目篩，制成辣木葉粉備用。

牛血清白蛋白(生化純)，濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、考馬斯亮藍(lán)G250，均為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水為實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)自制。

2.2 儀器設(shè)備

QFN-5200DTS超聲清洗器(上海觀謀事業(yè)有限公司)；Eppendorf Research移液器(量程20～200 μL，艾本德中國(guó)有限公司)；SC-3610低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；YP3002電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；PHS-3D型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海三信儀表廠)。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 辣木葉中蛋白質(zhì)超聲提取工藝流程

準(zhǔn)確稱取上述任意辣木葉粉樣品1.00 g放入250 mL燒杯中，加入特定pH特定量的超純水，超聲提取。將超聲處理后的固、液混合物分批次移入50 mL離心管中，5000 r/min離心10 min，合并上清液，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，于4 ℃冰箱中保存。

2.3.2 辣木葉中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白質(zhì)測(cè)定方法參考考馬斯亮藍(lán)G-250法[20]。以牛血清蛋白繪制蛋白質(zhì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算辣木樣品中蛋白質(zhì)含量，根據(jù)下述公式計(jì)算蛋白質(zhì)提取率，計(jì)算公式為：

蛋白質(zhì)提取率%=

2.3.3單因素試驗(yàn)對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)提取率的影響

固定溶劑pH值、料液比、提取溫度、超聲功率和提取時(shí)間5種因素中的4種，在合理范圍內(nèi)考察單因素對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)提取率的影響。其中pH值的考察范圍為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0；料液比的考察范圍為1∶40(g/mL)、1∶60(g/mL)、1∶80(g/mL)、1∶100(g/mL)、1∶120(g/mL)、1∶140(g/mL)、1∶160(g/mL)；超聲功率的考察范圍為40 W、45 W、50 W、55 W、60 W、65 W、70 W，提取溫度的考察范圍為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃；超聲提取時(shí)間的考察范圍為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。

2.3.4 響應(yīng)面法分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件，以溶劑pH、料液比、超聲功率、提取溫度、超聲時(shí)間5個(gè)因素為自變量，3個(gè)水平的方式進(jìn)行正交試驗(yàn)，以辣木葉中蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，考察各因素的影響水平，對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)提取率的影響

3.1.1 溶劑 pH的影響

溶劑pH值對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)提取率的影響如圖1a所示，當(dāng)溶劑pH值在8.0～10.0范圍內(nèi)逐漸升高時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率不斷提高；溶劑pH為10.0時(shí)蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值35.7%，繼續(xù)增加溶劑pH，蛋白質(zhì)提取率下降。這可能因?yàn)楫?dāng)pH在8.0～10.0范圍內(nèi)逐漸升高時(shí)，隨著堿濃度的逐漸增大，溶液中蛋白質(zhì)上較多的氨根離子呈現(xiàn)電離狀態(tài)，得到的游離蛋白質(zhì)逐漸增多，提取率提高；當(dāng)pH大于10.0的時(shí)候蛋白質(zhì)發(fā)生變性，導(dǎo)致蛋白出現(xiàn)脫氨、脫羧反應(yīng)，產(chǎn)生蛋白沉淀，從而降低了蛋白質(zhì)的提取率。實(shí)驗(yàn)溶劑pH選用10.0。

料液比對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)提取率的影響如圖1b所示。當(dāng)料液比從1∶40 (g/mL)增加至1∶120 (g/mL)時(shí)，隨著溶劑量的逐漸增加，蛋白質(zhì)提取率逐漸上升；當(dāng)料液比等于1∶120 (g/mL)時(shí)蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值38.3%；繼續(xù)增加溶劑的量，蛋白質(zhì)提取率并未出現(xiàn)太大變化。這可能是因?yàn)楫?dāng)液料比為1∶120 (g/mL)時(shí)植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)已經(jīng)全部溶出，繼續(xù)提升溶劑的量對(duì)于蛋白質(zhì)的提取率并無影響。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用1∶120 (g/mL)的料液比。

超聲功率對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)提取率的影響如圖1c所示。當(dāng)超聲功率在40 W～50 W之間逐漸升高時(shí)，蛋白質(zhì)提取率急劇升高；當(dāng)超聲功率等于60 W時(shí)蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值38.3%；當(dāng)超聲功率大于60 W時(shí)，蛋白質(zhì)提取率降低。這可能因?yàn)楫?dāng)功率在40 W～50 W之間逐漸升高時(shí)，植物細(xì)胞壁被破壞，蛋白質(zhì)容易從細(xì)胞內(nèi)部溶出，但當(dāng)超聲功率較大時(shí)，空化氣泡沒有足夠的時(shí)間破裂，空化效率降低，提取率下降[21]，從而降低蛋白質(zhì)回收率。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用超聲功率50 W。

超聲提取溫度對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)提取率的影響如圖1d所示。當(dāng)溫度從25℃升至50℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率不斷上升；提取溫度為50℃時(shí)蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大值40.3%；繼續(xù)提高溫度，蛋白質(zhì)提取率下降。這可能因?yàn)楫?dāng)溫度從25℃升至50℃時(shí)，蛋白質(zhì)在水中的溶解度逐漸增大；當(dāng)溫度繼續(xù)上升，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，形成大分子聚集體，從而降低了提取率[22]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用50℃。

圖1 各影響因素對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)提取率的影響(a).pH值影響；(b).料液比影響；(c).超聲功率影響；(d).提取溫度影響；(e).提取時(shí)間影響

超聲提取時(shí)間對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)提取率的影響如圖1e所示。當(dāng)提取時(shí)間從10 min-50 min逐漸增加時(shí)，蛋白質(zhì)提取率逐漸增加；50 min時(shí)蛋白質(zhì)提取率最大值42.4%；當(dāng)提取時(shí)間大于50 min時(shí)，提取率有小幅下降。這可能因?yàn)楫?dāng)提取時(shí)間在10 min-50 min之間時(shí)，隨著時(shí)間的增加蛋白質(zhì)溶出量逐漸增加；當(dāng)時(shí)間大于50 min，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白降解酶也隨之溶出，這些蛋白降解酶降解了部分溶出的蛋白[23]，降低了蛋白的提取率。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用超聲時(shí)間50 min。

綜上所述，經(jīng)單因素試驗(yàn)優(yōu)化后得到的最佳工藝為：溶劑pH 10.0，料液比1:120 (g/mL)，超聲功率50 W，提取溫度50 ℃，超聲時(shí)間50 min。

3.2 Box-Behnken模型對(duì)辣木中蛋白質(zhì)提取率的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)與分析的基礎(chǔ)上，考察最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件。以5因素3水平的方式進(jìn)行正交試驗(yàn)如表1所示。采用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken模型對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，軟件所給出的試驗(yàn)方案以及測(cè)得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示；多元回歸模型方差分析如表3所示。

表1 L46(35)試驗(yàn)因素及水平

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案及測(cè)得的試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

通過Dsign Expert 8.0.6對(duì)表2中數(shù)據(jù)的擬合，得到辣木葉中蛋白質(zhì)提取率Y對(duì)A、B、C、D、E的二元多次回歸方程為：

Y=42.45+0.78A+0.19B+0.32C-0.14D+0.36E-0.025AB-0.17AC+0.000AD-0.025AE+0.050BC+0.000BD+0.075BE+0.000CD+0.000CE-0.025DE-1.78A2-1.20B2-1.24C2-1.46D2-0.56E2

表3 多元回歸模型方差分析結(jié)果

注：*為P<0.01，顯著。

由表3可知，失擬項(xiàng)為1.47，說明該模型擬合度良好，能夠?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。A、B、C、D、E、AC、A2、B2、C2、D2、E2對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)提取率影響顯著。從F值的大小可以看出，對(duì)辣木葉中蛋白提取率有影響的5個(gè)因素中，影響的大小順序?yàn)椋篈>E>C>B>D，即pH值>提取時(shí)間>超聲功率>料液比>提取溫度，其中pH值和提取時(shí)間兩個(gè)因素對(duì)辣木葉中蛋白提取率的影響最為顯著。

3.3 最佳提取工藝及驗(yàn)證

通過Dsign Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，得到最佳提取條件為：pH值10.1、料液比1∶121.8 (g/mL)、提取功率50.6 W、提取溫度49.7 ℃、提取時(shí)間53.2 min，辣木葉中可溶性蛋白提取率的預(yù)測(cè)值為42.6%。實(shí)際實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，取100 g辣木葉干粉、pH值選用10.0、料液比選用1∶122 (g/mL)、超聲功率選用51 W、提取溫度選用50 ℃、提取時(shí)間選用53 min，進(jìn)行放大性實(shí)驗(yàn)，得到的辣木葉中蛋白的真實(shí)回收率為42.3%，與理論預(yù)測(cè)值的偏差較小，說明利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的辣木葉中蛋白質(zhì)的提取條件可靠。

3.4 市售辣木葉中蛋白質(zhì)含量比較

采用以上最佳提取工藝對(duì)從云南、廣東、廣西、福建、四川等不同產(chǎn)區(qū)隨機(jī)抽樣的26個(gè)辣木葉干品、19個(gè)辣木粉樣品、31個(gè)辣木茶樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)提取處理，對(duì)各樣品中的蛋白質(zhì)提取率進(jìn)行分析，結(jié)果如表4和圖2中所示。其中辣木葉干品樣品中測(cè)得蛋白質(zhì)提取率最小值為21.0%，最大值為38.1 %，平均值為27.7%；辣木粉樣品中測(cè)得蛋白質(zhì)提取率最小值為19.9%，最大值為35.5%，平均值為27.0%；辣木茶樣品中測(cè)得蛋白質(zhì)提取率最小值為12.9%，最大值為34.4%，平均值為28.3%。所有辣木葉產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量都在10%以上，90%以上產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量都在20%以上，說明辣木葉中的蛋白質(zhì)非常高，可以作為植物蛋白的替代來源。

表4 辣木葉干品、辣木粉樣品、辣木茶樣品中蛋白質(zhì)提取率

續(xù)表4

續(xù)表4

圖2 辣木葉產(chǎn)品中蛋白質(zhì)提取率對(duì)比率

4 結(jié)論

結(jié)合超聲提取法和響應(yīng)面法對(duì)辣木原料及其相關(guān)種產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)的提取條件進(jìn)行了分析研究，發(fā)現(xiàn)pH值、提取時(shí)間、超聲功率、料液比和提取溫度等因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響依次降低，其中pH值和提取時(shí)間兩個(gè)因素對(duì)辣木葉中蛋白質(zhì)提取率的影響最為顯著。最佳的提取條件為pH值10.0、料液比1∶122 (g/mL)、超聲功率51 W、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間53 min，此時(shí)得到的辣木葉中蛋白的真實(shí)回收率為42.3%，與理論預(yù)測(cè)值的偏差較小，說明利用Box-Behnken模型優(yōu)化得到的辣木葉中蛋白質(zhì)的提取條件可靠。本文將理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，避免了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，降低了實(shí)驗(yàn)工作量，提升了實(shí)驗(yàn)效率。最后對(duì)辣木原料及其相關(guān)產(chǎn)品中得蛋白質(zhì)進(jìn)行了提取和測(cè)定，進(jìn)一步證明了辣木葉中的蛋白質(zhì)含量很高，為現(xiàn)有辣木相關(guān)產(chǎn)品的深度開發(fā)和利用提供了應(yīng)用技術(shù)支持。