茶多酚對重鉻酸鉀染毒小鼠肝臟損傷的影響*

彭敏，劉燕群，2，3△，唐元娟，程露，楊曄，甘維康，李杜（.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430056；2.江漢大學(xué)光電化學(xué)材料與器件省部共建教育部重點實驗室，湖北武漢430056；3.江漢大學(xué)化環(huán)學(xué)院，湖北武漢430056）

工業(yè)上鉻的用途比較廣泛[1]，在某些職業(yè)環(huán)境中，鉻主要是以六價的形式存在于冶金等生產(chǎn)工業(yè)中。有相關(guān)實驗表明，在生產(chǎn)過程中接觸過多的六價鉻（Cr6+）會使人急性中毒而引起肝臟組織的損傷，嚴(yán)重時可誘發(fā)肺癌甚至是死亡[2]。日常生活中人們多有喝茶的習(xí)慣，茶多酚（TP）一般安全、無污染，且有強抗氧化作用，正逐漸受到人們的認(rèn)可。TP的芳香環(huán)可通過結(jié)合氧自由基中的羥基來清除機體內(nèi)的自由基，表現(xiàn)出強抗氧化能力[3]。肝臟是人體內(nèi)新陳代謝的樞紐和重要的解毒器官。肝臟如果受到影響，將會影響到人體健康。有關(guān)重鉻酸鉀鉻損害的機制研究很多，但對其損害的修復(fù)研究報道較少[4-5]，沈海濤等[6]進行了TP干預(yù)毒物研究，而利用生活中常見的茶葉提取含有多酚類化合物TP干預(yù)重鉻酸鉀（PD）致小鼠肝臟損傷的相關(guān)研究鮮見報道。鑒于此，本實驗擬采用PD使致小鼠中毒后用TP進行干預(yù)，觀察分析小鼠肝活性氧化酶指標(biāo)的變化和蘇木精-伊紅（HE）切片情況，探討TP對PD染毒小鼠肝臟損傷的影響，為相關(guān)研究提供實驗數(shù)據(jù)和分析依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 采用無特定病原體（SPF）昆明小鼠60 只，雌雄各半，體重（23±2）g，批號：42000600023316，購于湖北省實驗動物研究中心。小鼠身體狀態(tài)良好，安置于室溫（24±1）℃下，小鼠自由取水，每只小鼠喂食5 g飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。之后稱取每只小鼠的體重，根據(jù)體重差異隨機分為5組，每組12只，雌雄各半，使每組小鼠的平均質(zhì)量為30 g左右。

1.1.2 主要實驗儀器與試劑 TP（福州日冕科技開發(fā)有限公司），純度大于 98.0%；PD（K2Cr2O7，山東西亞化學(xué)股份有限公司），純度99.8%。JA2003B電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司），PH100-3A41L-EP生物顯微鏡（江西鳳凰光學(xué)集團有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性實驗 （1）預(yù)實驗：隨機挑選A、B 2組小鼠進行預(yù)實驗。①A組：根據(jù)相關(guān)研究，PD染毒昆明小鼠后，腎臟重量和腎臟系數(shù)均有顯著升高，且濃度為21.375 mg/kg的組別升高最為明顯[7]。本研究采用1/8的PD半數(shù)致死量（LD50）為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置濃度梯度，1/4 LD50為上限，0為下限，設(shè)置8個濃度梯度，分別為1/4 LD50、1/8 LD50、1/12 LD50、1/16 LD50、1/20 LD50、1/24 LD50、1/32 LD50、0（生理鹽水）的PD溶液，分別給8只昆明小鼠灌胃。每6小時1次，每只每次灌胃0.3 mL，每天連續(xù)灌胃3次，連續(xù)灌胃3 d。不斷持續(xù)觀察小鼠的生活狀態(tài)和活動能力，3 d后解剖觀察小鼠肝臟變化情況，選出1個能使小鼠恰好表現(xiàn)中毒情況又不致死的適宜濃度作為正式實驗PD的灌胃濃度。解剖前，小鼠生活狀態(tài)不佳，精神萎靡，較安靜。解剖后，因為1/4 LD50組小鼠肝臟對比0（生理鹽水）組及其他組小鼠，肝臟腫大最明顯，顏色暗沉且色澤不均，仔細(xì)用肉眼可觀察到各葉肝臟邊緣及中部均有彌漫的小結(jié)節(jié)，表現(xiàn)出明顯病理特征。故以1/4 LD50為最適PD灌胃濃度進行正式實驗。②B組：經(jīng)查閱相關(guān)文獻[6]，設(shè)置5個濃度梯度，分別以濃度為 200、300、400、500、600 mg/kg的 TP 溶液給 10只昆明小鼠灌胃，每個濃度組2只，灌完1/4 LD50PD溶液后隔4 h灌胃TP溶液即為一輪灌胃，每次灌胃量為0.3 mL，每天連續(xù)灌胃2輪，每天給另2只小鼠灌胃2次1/4 LD50PD溶液，作為對照組，連續(xù)灌胃3 d。解剖前，各組小鼠的活動能力和生活狀態(tài)沒有明顯區(qū)別。解剖后，對比各組小鼠肝臟病理特征，200、400、600 mg/kg組小鼠的肝臟色澤相對鮮紅，小結(jié)節(jié)較少，病理變化少。故選取200、400、600 mg/kg作為正式實驗TP灌胃濃度。（2）正式實驗：將60只昆明小鼠分為5組，每組12只，雌雄各半，在24℃室溫下分籠，早上08：00至晚上18：00燈光照明飼養(yǎng)。假設(shè)每只小鼠重量為30 g，每天灌胃量為0.3 mL。根據(jù)計算結(jié)果，配制濃度為4.275 mg/mL的1瓶PD溶液和濃度為200、400、600 mg/kg的3瓶TP溶液于4℃冰箱內(nèi)避光儲存?zhèn)溆?。對照組灌胃生理鹽水，PD染毒組灌胃42.75 mg/kg PD溶液；在灌胃PD 6 h后，TP 組分別按 200、400、600 mg/kg濃度灌胃TP溶液（即PD+L-TP組、PD+M-TP組、PD+H-TP組）。各組灌胃時間均為2周，每天1次；每只小鼠每次灌胃體積均為0.3 mL。觀察每天小鼠的生活狀態(tài)，記錄小鼠的體重。準(zhǔn)備解剖之前，各組小鼠自由取水，最后1次灌胃后禁食24 h。解剖小鼠時，頸椎脫位法處死小鼠，采血、取肝臟稱重并制作肝臟的HE染色切片并計算其臟器系數(shù)；離心后的血清用全自動生化分析儀檢測肝組織谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）水平。

1.2.2 肝組織HE染色切片的制作 處死并解剖全部小鼠并取其肝臟，稱量后，投入4%甲醛溶液中固定，保持細(xì)胞形態(tài)。乙醇脫水后，再將組織塊置于二甲苯中。石蠟包埋后切片，切成的薄片固定于載玻片上，放入45℃恒溫箱內(nèi)烘干。二甲苯可脫去切片中的石蠟，再經(jīng)過高濃度到低濃度乙醇洗脫后，用蒸餾水洗。HE染色后，制成肝的HE染色切片[8-10］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理實驗各組相關(guān)數(shù)據(jù)，計量資料采用表示，并用單因素方差分析法進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體重及肝臟臟器系數(shù)比較 PD染毒組體重和臟器系數(shù)均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PD+L-TP、PD+H-TP組與PD染毒組比較，小鼠體重有一定程度的增加，PD+L-TP、PD+m-TP組小鼠肝臟臟器系數(shù)均低于PD染毒組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體重及肝臟臟器系數(shù)比較（±s）

表1 各組小鼠體重及肝臟臟器系數(shù)比較（±s）

注：與對照組同指標(biāo)比較，aP＜0.05；與PD染毒組同指標(biāo)比較，bP＜0.05

組別對照組PD染毒組PD+L-TP組PD+M-TP組PD+H-TP組n 12 12 12 12 12體重（g）30.78±1.18 26.87±2.61a 30.02±1.22b 28.75±1.46 30.07±3.26b肝臟臟器系數(shù)（%）4.69±0.61 5.25±0.33a 4.39±0.45b 4.34±0.25b 4.75±0.37

2.2 各組小鼠肝功能指標(biāo)比較 PD染毒組小鼠血清ALT、AST、GGT水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)不同劑量 TP 干預(yù)后，PD+L-TP、PD+m-TP、PD+H-TP組的血清 ALT、AST、GGT 水平均分別低于PD染毒組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肝功能指標(biāo)比較（±s）

表2 各組小鼠肝功能指標(biāo)比較（±s）

注：與對照組同指標(biāo)比較，aP＜0.05；與PD染毒組同指標(biāo)比較，bP＜0.05

GGT（U/L）2.34±0.37 3.91±0.09a 2.90±0.68b 2.21±0.38b 2.85±0.78b組別對照組PD染毒組PD+L-TP組PD+M-TP組PD+H-TP組n 12 12 12 12 12 ALT（U/L）49.48±1.46 57.96±9.33a 42.60±3.68b 44.0±1.71b 41.43±0.63b AST（U/L）131.73±22.57 159.85±4.12a 134.15±8.21b 133.66±5.57b 134.58±13.51b

2.3 顯微鏡觀察 將各組小鼠肝臟HE染色切片分別置于低倍鏡和40倍光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，對照組（生理鹽水）肝小葉之間界限較清楚，細(xì)胞在肝小葉中部的中央靜脈周圍呈放射狀排列，肝細(xì)胞間連接緊密，可見肝血竇和門管區(qū)；小鼠肝細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，染色質(zhì)豐富（圖1）。PD染毒組肝小葉界限不清楚，肝細(xì)胞水腫，有部分細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞界限不清，有雙核，核深染，有些中央靜脈輪廓不清楚，大多數(shù)充血（圖 2）。PD+L-TP、PD+m-TP、PD+H-TP組肝小葉界限較清楚，細(xì)胞輕度水腫，較少壞死，大多細(xì)胞界限清楚，中央靜脈大多輪廓清楚，充血少（圖3～5）。

圖1 對照組（HE染色，40×）

圖2 PD染毒組（HE染色，40×）

圖4 PD+M-TP組（HE染色，40×）

圖5 PD+H-TP組（HE染色，40×）

3 討 論

本實驗采用TP作用PD染毒小鼠肝臟，結(jié)果證實，在TP的干預(yù)下，TP對PD染毒肝臟所致的損傷有一定程度的保護作用。

實驗動物的臟器系數(shù)可反映毒物對臟器的綜合毒性損傷程度，其增大表明臟器出現(xiàn)了水腫、增生和充血等病理變化，若下降則說明器官表現(xiàn)出萎縮和退行性病變等變化[11]。動物的體重也是研究毒理學(xué)中非特異性觀察指標(biāo)之一。體重和臟器系數(shù)可以綜合反映機體的中毒效應(yīng)。本實驗圖2結(jié)果顯示，與對照組比較，PD染毒小鼠肝臟的臟器系數(shù)增高，說明PD溶液可引起肝臟水腫、壞死等病理變化，HE染色切片也顯示肝細(xì)胞水腫、出血，部分細(xì)胞壞死；PD染毒組小鼠體重下降，與李銀等[12]的實驗結(jié)果一致。主要是由于PD在體內(nèi)蓄積引起的毒性反應(yīng)，致小鼠消化不良，食欲不振，從而進食量減少，這也是小鼠體重下降的直接原因。本研究圖3～5表明，經(jīng)不同劑量TP干預(yù)后，小鼠肝臟臟器系數(shù)均呈不同程度降低，體重增加，表明TP干預(yù)后可減輕PD蓄積毒性對機體的影響，不斷改善和修復(fù)PD對肝臟的損傷作用，并使其生理功能逐漸恢復(fù)而增加體重，HE染色切片顯示肝細(xì)胞界限較為明顯，出血和壞死情況較少。

分析肝臟功能最常用的方法是肝酶活性的檢測，這通常也是研究肝臟損害較常規(guī)和便捷的方法之一。相關(guān)研究表明，嚴(yán)重?fù)p傷的肝細(xì)胞一般會出現(xiàn)ALT、AST和GGT水平升高，三者的變化能夠幫助判斷肝臟是否損傷及其損傷程度和性質(zhì)[13]。本實驗結(jié)果顯示，PD染毒組ALT、AST、GGT 3項指標(biāo)水平均升高，表明PD可增強脂質(zhì)過氧化而損傷肝臟；TP干預(yù)后，ALT、AST、GGT水平均低于PD染毒組，說明TP對PD引起的肝酶升高和肝臟組織形態(tài)破壞均有不同程度的保護作用，可能與其表現(xiàn)出的強大抗氧化能力有關(guān)。但其具體保護機制及其所需的最佳濃度尚需要進一步深入研究探討。