高頻電療對(duì)急性脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)和BDNF-TrkB表達(dá)的影響

周剛，王佳君

（湖北省黃岡市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 黃岡 438000）

近年來(lái)隨交通運(yùn)輸及建筑業(yè)發(fā)展，急性脊髓損傷（Acute spinal cord injury，ASCI）發(fā)生率呈上升趨勢(shì)[1]。目前尚無(wú)治療ASCI的理想方法，給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，其治療處于多途徑多學(xué)科探索階段。高頻電場(chǎng)療法（簡(jiǎn)稱(chēng)高頻電療）是一種應(yīng)用波長(zhǎng)為10-100 m的超高頻交流電作用于生物體，以達(dá)到治療目的。有基礎(chǔ)研究表明[2]，高頻電療可改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能，抑制Caspase3及海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷，而發(fā)揮腦保護(hù)作用，但在ASCI中應(yīng)用較少。本文應(yīng)用改良Alen’s法建立大鼠ASCI模型，觀察高頻電療法（無(wú)熱量短波、超短波、微波）對(duì)其神經(jīng)功能恢復(fù)及損傷段脊髓BDNF-TrkB表達(dá)的影響，為ASCI的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)成年雌性SD大鼠75只，均10周齡，體重22-24 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，在20-22℃、50%-60%濕度下飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（瀘）2013-0016。

誘捕早春出蟄活動(dòng)的成蟲(chóng)?？稍谠簝?nèi)按一定距離投放廢筍，一般上午8時(shí)～9時(shí)投撒，下午1時(shí)～2時(shí)收集捕殺。幼蟲(chóng)活動(dòng)性差，爬行緩慢，成蟲(chóng)在清晨也很少飛翔，在其捕食為害時(shí)極易撲捉，利用成蟲(chóng)的假死性用網(wǎng)蟲(chóng)撲殺效果也較好。

1.2 主要儀器 手術(shù)器械，注射器，微細(xì)咬骨鉗，modelⅠ型NYU脊椎沖擊損傷儀（美國(guó)新澤西州立大學(xué)神經(jīng)科學(xué)聯(lián)合中心）；日本伊藤SW180短波治療儀，南京產(chǎn)微波治療儀MTC-3-500，UWM-02型超短波治療儀（日本丸高）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡），數(shù)顯恒溫漂片儀（常州中威），全自動(dòng)HE染色機(jī)（丹麥 Dako），臺(tái)式高速離心機(jī) （德國(guó) Eppendorf），Olympus BX41顯微鏡（日本Olympus）等。

1.3 主要試劑 抗BDNF兔源單克隆抗體（美國(guó)ABcam公司）；抗TrkB兔源多克隆抗體（美國(guó)Millipore公司）；DAB顯色液（DAko）。

計(jì)算出d(Ei,Ej)后，再計(jì)算兩證據(jù)之間的相似度Sij=1-d(Ei,Ej)(i,j=0,1,2，…，k)，得到相似度矩陣S。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)軟件檢驗(yàn)呈正態(tài)性分布且方差齊性，行t檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布各變量間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析、以相關(guān)系數(shù)r表示兩資料間的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1 Zea-Longa評(píng)分比較 隨時(shí)間延長(zhǎng)，損傷各組評(píng)分均降低，但損傷各組各時(shí)點(diǎn)Zea-Longa評(píng)分均高于 S1組（P＜0.05）；各時(shí)點(diǎn) S2、S3 組 Zea-Longa評(píng)分低于S4、S5組，且S3組各時(shí)點(diǎn)Zea-Longa評(píng)分低于S2組，2周、3周時(shí)S4組Zea-Longa評(píng)分低于S5組（P＜0.05）。見(jiàn)表 1。

1.4.3 干預(yù)治療 治療前均排空尿液，將其俯臥位固定在自制木制槽型裝置，在造模后1 d對(duì)損傷部位進(jìn)行治療。S2組給予無(wú)熱量短波（頻率27.12 MHz，鼓形輻射器直徑7 cm）照射治療，輻射器垂直置于傷口上方及皮膚間隙2-3 cm，選擇連續(xù)輸出，照射強(qiáng)度10W，10min/次，1 次/d，照射至取材前 1 d；S3 組給予超短波治療，兩電極板對(duì)置于大鼠損傷區(qū)脊髓兩側(cè)，電極板與脊髓皮膚間隙2-3 cm，選擇第1檔輸出功率，照射強(qiáng)度10 W，10 min/次，1次/d，照射至取材前1 d。S4組給予微波治療（頻率2450 MHz，輻射器直徑10 cm），輻射器垂直置于傷口上方及皮膚間隔8 cm處，連續(xù)輸出，照射強(qiáng)度10 W，10 min/次，1次/d，照射至取材前1 d。S1組僅切除低T10胸椎及其上下棘突與椎板，不進(jìn)行脊髓打擊，不進(jìn)行物理因子治療；S5組在ASCI造模成功后不給于損傷部位物理因子干預(yù)。

1.4.2 ASCI模型制備 應(yīng)用改良Alen’s法建立大鼠ASCI模型。按0.33 ml/100 g的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，以T10棘突為中心備皮，將大鼠俯臥位固定在手術(shù)板上，以碘伏消毒，鋪無(wú)菌洞巾。沿T10中心在背部正中切開(kāi)皮膚，逐層分離筋膜肌肉，后將T9-T11棘突與兩側(cè)椎板充分暴露，咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，暴露脊髓背側(cè)硬膜，確保硬脊膜完整。應(yīng)用NYU脊椎沖擊損傷儀在自硬脊膜25 mm高處自由垂直落下撞擊T10段脊髓硬脊膜，撞擊能量25 mm×10 g，損傷直徑2.5 mm。打擊后大鼠身體痙攣性顫動(dòng)，尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)，雙后肢及軀體回縮樣撲動(dòng)，雙后肢弛緩性癱瘓，且硬膜表面充血水腫，即表明造模成功。術(shù)畢，無(wú)菌生理鹽水沖洗傷口，縫合，棉布巾覆蓋保溫，蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)。在后肢肌注青霉素G20萬(wàn)U預(yù)防感染，并人工擠壓膀胱協(xié)助排尿。S1組（假手術(shù)組）僅單純咬除T9-T11段椎板、棘突，而不損傷脊髓。

上述研究表明，跨文化交際學(xué)的“修辭轉(zhuǎn)向”重申了通過(guò)承認(rèn)不同主張、文化或個(gè)體來(lái)建立一個(gè)和諧社會(huì)或世界，而不是對(duì)文化差異擺出不加分辨的寬容態(tài)度的重要性。

1.5.1 采用Zea-Longa五級(jí)評(píng)分法評(píng)估神經(jīng)功能，0分：無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：不能完全伸展左前肢，輕度局灶性神經(jīng)功能缺失；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺失；3分：向左側(cè)傾倒，重度神經(jīng)功能缺失；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)水平低，評(píng)分越高代表神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。于術(shù)前、脊髓損傷后1d、1周、2周、3周進(jìn)行雙盲法評(píng)分。

1.5 觀察指標(biāo)

1.2.3 感官評(píng)價(jià)。參考其他水產(chǎn)品的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[7]，制定克氏原螯蝦的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。由6名經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的感官評(píng)定人員進(jìn)行，按照表1進(jìn)行綜合評(píng)分。在克氏原螯蝦凍結(jié)后0、10、20、30、40、50、60 d進(jìn)行色澤、體表、肌肉及90 ℃水煮5 min 的氣味和湯汁評(píng)價(jià)。總分值在10分(最好品質(zhì))和0分(最差品質(zhì))。

1.5.2 BDNF、TrkB測(cè)定 ①取材及切片制備：于神經(jīng)功能評(píng)分同時(shí)點(diǎn)取材，以10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，動(dòng)物麻醉后斷頭，排空血液，打開(kāi)暴露脊髓，剪取損傷區(qū)尾端L2-L5段脊髓組織，置于10%中性甲醛中固定；②經(jīng)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片后，采用BDNF、TrkB試劑盒行免疫組化染色，中性樹(shù)脂封片保存，以PBSA代替一抗作陰性對(duì)照，以相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照切片作陽(yáng)性對(duì)照，在顯微鏡下（400×）觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（棕黃色），并拍照，以單個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

2 結(jié)果

1.4.1 分組 將75只大鼠隨機(jī)分為S1、S2、S3、S4、S5五組，各15只。

表1 Zea-Longa評(píng)分比較（，分，n=15）

2.2 損傷各組BDNF、TrkB細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)比較 損傷1周時(shí)各組BDNF、TrkB細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)達(dá)高峰，且S3組最高，S2組次之，S4、S5 組低于 S2、S3 組（P＜0.05）；隨后均下降，2周時(shí)S2、S3組高于S4、S5組，S3組高于S2組（P＜0.05）；3周時(shí)S5組低于初始水平，且S2、S3、S4組高于 S5組，S3組高于 S2組、S4組（P＜0.05）；損傷 1d、1周、2周 S4組 BDNF、TrkB 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與S5組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 2、表 3。

表2 損傷各組BDNF細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)比較（±s，個(gè)/視野，n=15）

表2 損傷各組BDNF細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)比較（±s，個(gè)/視野，n=15）

注：與同組損傷1d比較，①P＜0.05；與S2組同時(shí)點(diǎn)比較，②P＜0.05；與S3組同時(shí)點(diǎn)比較，③P＜0.05；與S4組同時(shí)點(diǎn)比較，④P＜0.05。

組別 1d 1周 2周 3周S2 5.64±0.62 13.16±1.15① 10.13±1.12① 6.64±0.71①S3 5.63±0.64 16.10±1.63①② 12.44±1.35①② 7.83±0.91①②S4 5.65±0.63 10.25±2.06①②③ 8.13±1.21①②③ 5.89±0.74①②③S5 5.66±0.63 9.82±0.99①②③ 7.91±0.85①②③ 5.19±0.62①②③④

表3 損傷各組TrkB細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)比較（±s，個(gè)/視野，n=15）

表3 損傷各組TrkB細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)比較（±s，個(gè)/視野，n=15）

注：與同組損傷1d比較，①P＜0.05；與S2組同時(shí)點(diǎn)比較，②P＜0.05；與 S3組同時(shí)點(diǎn)比較，③P＜0.05；與 S4組同時(shí)點(diǎn)比較，④P＜0.05。

組別 1d 1周 2周 3周S2 6.35±1.20 15.69±1.61① 10.56±1.17① 6.69±0.71①S3 6.32±1.23 19.88±2.10①② 12.89±1.34①② 7.35±0.75①②S4 6.34±1.21 12.56±1.31①②③ 8.99±0.91①②③ 6.53±0.58①②③S5 6.36±1.18 11.37±1.24①②③ 8.54±0.86①②③ 5.40±0.57①②③④

2.3 Zea-Longa評(píng)分與 BDNF、T rkB相關(guān)性分析ASCI大鼠損傷后3周內(nèi)，Zea-Longa評(píng)分與BDNF、TrkB陽(yáng)性率呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 Zea-Longa評(píng)分與BDNF、TrkB相關(guān)性分析

3 討論

ASCI是臨床較嚴(yán)重的創(chuàng)傷性疾病，機(jī)體在外力、機(jī)械力所致的原發(fā)性損傷后，脊髓周?chē)Y(jié)構(gòu)局部缺血、出血、微循環(huán)損傷，繼而導(dǎo)致繼發(fā)性損傷，給臨床治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。動(dòng)物及人體研究表明[3-4]，脊髓損傷后即使未經(jīng)治療，缺損的神經(jīng)功能也可部分恢復(fù)，證實(shí)脊髓存在一定的可塑性，這也提示臨床在治療ASCI時(shí)可由神經(jīng)保護(hù)轉(zhuǎn)向促進(jìn)神經(jīng)再生，即促進(jìn)神經(jīng)元存活及替換，通過(guò)軸突再生與重塑而建立新的神經(jīng)回路，部分代償喪失的神經(jīng)功能。高頻電療是以生物體在高頻磁場(chǎng)中可表現(xiàn)出導(dǎo)體、電容、電介質(zhì)、線圈等性質(zhì)的原理的物理療法，治療時(shí)電極板發(fā)出高頻電磁波，產(chǎn)生震蕩電磁場(chǎng)，帶電離子在電場(chǎng)強(qiáng)度最大瞬間向磁場(chǎng)方向伸展，在電場(chǎng)強(qiáng)度最小瞬間離子又恢復(fù)原狀，當(dāng)電磁波連續(xù)或脈沖式作用于生物體時(shí)，可產(chǎn)生電流，發(fā)揮熱效應(yīng)或非熱效應(yīng)，當(dāng)電場(chǎng)頻率適當(dāng)時(shí)，細(xì)胞受到刺激而引起生物學(xué)作用，其中最常見(jiàn)的為短波、超短波、微波，研究證實(shí)對(duì)神經(jīng)損傷后的修復(fù)與再生有確切療效，但目前在ASCI中應(yīng)用較少[5]。

本次研究結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，損傷各組評(píng)分均降低，但損傷各組各時(shí)點(diǎn)Zea-Longa神經(jīng)功能評(píng)分均高于S1組，而S2、S3組在各時(shí)點(diǎn)Zea-Longa評(píng)分優(yōu)于S4、S5組，2周、3周時(shí) S4組 Zea-Longa評(píng)分低于S5組，但S5組損傷后1-3周Zea-Longa神經(jīng)功能評(píng)分較同組損傷1d呈下降趨勢(shì)，提示ASCI后，神經(jīng)功能是一個(gè)自我恢復(fù)的過(guò)程，而采用高頻電療對(duì)神經(jīng)功能損傷有較好的修復(fù)作用，縮短恢復(fù)時(shí)間，使神經(jīng)功能盡快恢復(fù)，但微波療法不宜過(guò)早使用，且劑量應(yīng)小，這與Pang等[6]通過(guò)研究得出的結(jié)論相近。BDNF為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族重要成員，通過(guò)旁分泌或自分泌作用與鄰近細(xì)胞膜特異性受體TrkB結(jié)合而促進(jìn)神經(jīng)元存活、增殖，突出其可塑性作用，繼而促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生與修復(fù)[7-8]，Zhou等[9]的研究結(jié)果表明BDNF可能通過(guò)與其受體TrkB結(jié)合，而啟動(dòng)眾多信號(hào)通路傳導(dǎo)，發(fā)揮其促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)的作用，可見(jiàn)BDNF、TrkB在ASCI神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)及肢體運(yùn)動(dòng)功能改善方面起著重要作用。本次研究結(jié)果顯示，損傷1周時(shí)各組BDNF、TrkB細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)達(dá)高峰，且S3組最高，S2組次之，S4、S5組低于S2、S3組，在損傷后1-2周時(shí)這種差異最明顯，而在3周差異趨勢(shì)減小，甚至在3周時(shí)S5組低于初始水平，而S2、S3、S4組BDNF、TrkB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)維持在較高水平，此外相關(guān)分析顯示 ASCI大鼠損傷后 3周內(nèi)，Zea-Longa評(píng)分與BDNF、TrkB陽(yáng)性率呈負(fù)相關(guān)，這與謝財(cái)忠等[10]的研究結(jié)果相似，提示無(wú)熱量短波或超短波可較好調(diào)動(dòng)內(nèi)源性BDNF合成增加或轉(zhuǎn)運(yùn)增加，促進(jìn)局部運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)神經(jīng)元的存活、軸突生長(zhǎng)，阻止神經(jīng)元死亡、促進(jìn)其存活與修復(fù)；微波也能刺激BDNF-TrkB表達(dá)，加快脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)，但效果較短波或超短波弱，考慮與微波超高頻電磁場(chǎng)中發(fā)生振蕩較短波、超短波更為劇烈，偶極子旋轉(zhuǎn)、有極分子擺動(dòng)過(guò)于劇烈有關(guān)，對(duì)尚處于損傷急性應(yīng)激刺激階段的脊髓來(lái)說(shuō)可能是不利的。

綜上所述，高頻電療可明顯改善ASCI大鼠神經(jīng)功能，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，可能通過(guò)上調(diào)BDNF-TrkB表達(dá)而發(fā)揮作用。

葉總接過(guò)話茬：“這么看來(lái)，我猜的就八九不離十了。老賈成功騙過(guò)我們之后，就剩下釣?zāi)憬淌谏瞎戳?。那天我提前離開(kāi)酒席之后，他怕夜長(zhǎng)夢(mèng)多，便用錢(qián)盒子為餌，促成交易。仔細(xì)想想，看來(lái)老賈真的是以為這個(gè)盒子不太值錢(qián)，所以才把它當(dāng)陪襯送給了陸教授?！?/p>