以Fe（Ⅲ）為電子受體的聚磷菌篩選、鑒定及聚磷特性

任麗平，張 智，唐 赟

（1.重慶大學(xué) 城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶400030；2.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川南充637002）

現(xiàn)代污水生物強(qiáng)化除磷法是通過聚磷菌超量攝取廢水中的磷，以聚磷酸鹽的形式積累于細(xì)胞內(nèi)，然后作為剩余污泥排出，從而實(shí)現(xiàn)磷的去除。在該過程中聚磷菌起著關(guān)鍵的作用，目前研究表明假單胞菌屬（Pseudomonas）是生物除磷的重要功能菌，是厭氧／好氧條件下的主要菌種之一［1］，并在試驗(yàn)過程中一直保持著較為穩(wěn)定的優(yōu)勢地位［2］。目前，僅發(fā)現(xiàn)其超量吸磷反應(yīng)的電子受體有2類，一類是以O(shè)2為電子受體，在好氧條件下完成吸磷，另一類是以NO3－、NO2－為電子受體，在缺氧條件下完成吸磷，前者稱為好氧聚磷菌（APB），后者稱為反硝化聚磷菌（DPB）［3］。同時(shí)，該過程受到溶氧、有機(jī)物、pH值［4］、厭氧時(shí)間［5］、金屬離子［6］以及 NO3－、NO2－濃度［7］等因素的影響。目前，生物除磷仍處于發(fā)展階段，生物除磷效果不穩(wěn)定，大多數(shù)學(xué)者集中于除磷工藝的改進(jìn)，而相關(guān)的機(jī)理研究還不夠成熟。對聚磷機(jī)理研究的最大障礙是高活性聚磷菌的獲得，至今分離、鑒定的聚磷菌仍然是極少數(shù)［8］，新的分離方法仍在不斷探索中［9］。而人們利用分子工具對污水反應(yīng)器的調(diào)查結(jié)果表明污水微生物具有多樣性，許多未培養(yǎng)微生物被發(fā)現(xiàn)在脫磷中扮演著重要角色［10］。

為達(dá)到較好的除磷效果，大多數(shù)城市污水處理廠采用生物化學(xué)協(xié)同除磷工藝，充分利用生物除磷費(fèi)用低、化學(xué)除磷出水磷濃度低且比較穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。用于廢水除磷的化學(xué)藥劑主要有鋁鹽、鐵鹽和石灰。鐵鹽是良好的化學(xué)同步除磷藥劑，有三價(jià)鐵鹽和亞鐵鹽2種形式，人們關(guān)注了其在除磷中的作用［11－12］，并對生化聯(lián)合除磷工藝中主要參數(shù)的控制指標(biāo)進(jìn)行了試驗(yàn)研究，但對其機(jī)理分析不夠深入。Fe（Ⅲ）還原是地球上最早的呼吸形式之一［13］，不少的微生物種類都具有以Fe（Ⅲ）為電子受體的能力或潛能。迄今，研究人員已經(jīng)從各種厭氧環(huán)境中分離得到了種類不同的Fe（Ⅲ）還原微生物，包括活性污泥中的鐵還原微生物［14］?；钚晕勰嘀械蔫F還原微生物與聚磷菌有無關(guān)系、聚磷菌能否以Fe（Ⅲ）為電子受體以及Fe（Ⅲ）的生物化學(xué)協(xié)同除磷具體情況如何，至今未見研究報(bào)道。

微生物可培養(yǎng)性低的主要生態(tài)學(xué)原因是細(xì)菌共同協(xié)作的自然生存方式的崩潰、生境的極度營養(yǎng)化和生態(tài)位巨變等?；旌吓囵B(yǎng)、稀釋培養(yǎng)和模擬自然培養(yǎng)等研究手段和策略，可在不同程度上解決可培養(yǎng)性低的問題。該實(shí)驗(yàn)采用稀釋培養(yǎng)法從活性污泥中篩選、分離出以Fe（Ⅲ）為電子受體的高活性聚磷菌，并對其進(jìn)行生理生化特征、16SrDNA進(jìn)化分析和厭氧聚磷特性研究，旨在為豐富聚磷菌種、進(jìn)一步深入研究聚磷機(jī)理和充分發(fā)揮Fe（Ⅲ）的生物化學(xué)協(xié)同除磷作用以及實(shí)現(xiàn)高效低耗的除磷奠定基礎(chǔ)。

1 材料

活性污泥取自某城市污水處理廠厭氧段、缺氧段、好氧段各2份，共6份。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基

1）牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（L－1）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，pH7.0。

2）LB固體培養(yǎng)基（L－1）：NaCl 10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，pH7.0。

3）檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基（L－1）：檸檬酸鐵3.4g，NH4Cl 1g，CaCl2·2H2O 0.07g，MgSO4·7H2O 0.6g，K2HPO4·3H2O 0.733g，KH2PO40.25g，葡萄糖10g，pH6.5－7.0。

4）無鐵液體培養(yǎng)基（L－1）：NH4Cl 1g，CaCl2·2H2O 0.07g，MgSO4·7H2O 0.6g，K2HPO4·3H2O 0.733g，KH2PO40.25g，葡萄糖10g，pH6.5－7.0。

2.2 菌株的分離及純化

分別取6份活性污泥原液逐級稀釋至10－4，將稀釋后的活性污泥分別加于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，27℃厭氧靜置培養(yǎng)9h，然后好氧培養(yǎng)15h（即參照A／O工況馴化培養(yǎng)）。將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液分別涂布在LB固體培養(yǎng)基上，重復(fù)以上條件馴化培養(yǎng)1d。挑取單菌落純化至菌落特征一致，無異常菌落出現(xiàn)者，可認(rèn)為是單菌落。挑取單一菌落接種到斜面培養(yǎng)基上保存、備用。

2.3 菌株的內(nèi)聚物染色

將單一菌落分別接種于LB固體平板培養(yǎng)基上，27℃下厭氧培養(yǎng)9h，進(jìn)行PHB染色，再好氧培養(yǎng)15h，進(jìn)行poly－P染色。將具有雙染色特征的菌株接種在甘油管中保存、備用。

2.4 具有還原Fe（Ⅲ）的聚磷菌株的篩選

活化具有雙染色特征的菌株，接種于充滿經(jīng)稀釋10倍的檸檬酸鐵和無鐵液體培養(yǎng)基的試管中，厭氧避光27℃靜置培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色變化。

2.5 菌株的16SrDNA分析

提取目標(biāo)菌總DNA，以總DNA為模板擴(kuò)增其16SrDNA。PCR反應(yīng)體系（50μL）：無菌去離子水37.5μL，10×Buffer 5.0μL，MgCl23μL，10mmol／L dNTPs1.0μL，10μmol／L引物1（5'－CCGA ATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTC AG－3'）1.0 μL，引 物 2（5'－CCCGGGATCCAA GCTTAAGGAGGTGATCCAGCC－3'）1.0 μL，Taqplus聚合酶（5U／μL）0.5μL，模板DNA 2μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸10min，30個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5min，4℃保溫2h。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳EB染色后，用紫外分析儀檢測。用上海生工的UNIQ－100DNA膠純化試劑盒回收瓊脂糖凝膠上的PCR產(chǎn)物，用TaKaRaPMD19－T載體試劑盒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，然后在含氨芐青霉素Amp／IPTG／Xgal的平板上篩選白斑，并進(jìn)行菌體PCR初步檢測，再經(jīng)堿裂解法提取質(zhì)粒，其產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。16SrDNA的測序由上海生工完成。用BLAST軟件，將測定得到的16SrDNA全序列遞交于GenBank，并與GenBank／EMBL／DDBJ中的已知序列進(jìn)行同源性分析。

2.6 厭氧聚磷菌株的聚磷特性研究

活化具有還原Fe（Ⅲ）的聚磷菌株，接種于充滿經(jīng)稀釋10倍的檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基的試管中，厭氧避光27℃靜置培養(yǎng)，每5h測定培養(yǎng)基中上清液磷濃度、沉淀磷濃度、菌體含磷量、Fe（Ⅱ）濃度和菌OD值。

測定方法參照國家環(huán)保總局頒布的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。磷采用鉬銻抗分光光度法700nm測定；Fe（Ⅱ）采用鄰菲啰啉分光光度法510nm測定；OD值采用分光光度600nm測定；聚磷菌的菌體含P量的測定方法為，取菌懸液以12 000r／min離心10min，用無菌水溶解，再離心，重復(fù)3次得濕菌體，于105℃烘至恒重，稱菌體干重。在無菌條件下，取菌液用超聲波破碎菌體（破碎條件：輸出功率為200W，工作時(shí)間4s，間隔時(shí)間4s，共破碎180次）后，再用過硫酸鉀進(jìn)行消解，按總磷測定方法測菌體含磷量。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株的篩選和分離

從6份樣品中共分離純化出36個(gè)形態(tài)不同的菌落，經(jīng)PHB染色和polyP染色，具有雙染色特征即含PHB顆粒和異染顆粒的單菌落8株，初步判斷具有聚磷特征，分別編號(hào)為AP3、AP4、AP5、AP7、AP8、AP9、AP10、AP11。

初選的8株聚磷菌經(jīng)厭氧培養(yǎng)3d后，AP3、AP7、AP11 3個(gè)試管中的顏色變淺，見圖1a，沒有編號(hào)的試管為無菌對照組；培養(yǎng)7d后，AP3、AP7、AP11試管中顏色完全變白，見圖1b。已知可溶性Fe（Ⅲ）到可溶性Fe（Ⅱ）的氧化還原電勢（＋0.77V）同O2還原為水的氧化還原電勢（＋0.82V）很接近，厭氧條件下，不少微生物具有利用Fe（Ⅲ）進(jìn)行呼吸獲能的能力。培養(yǎng)基顏色變白表明其中的檸檬酸鐵被還原，AP3、AP7、AP11菌株具有還原Fe（Ⅲ）的功能。

圖1 菌株AP3厭氧培養(yǎng)顏色

3.2 菌株AP3的16SrDNA鑒定

菌株AP3序列測定結(jié)果的基因登錄號(hào)為HM628703。在GenBank上用Blast程序?qū)赀M(jìn)行核苷酸同源性比對，菌株AP3與Pseudomonas mosselii ATCCBAA－99［15］的同源性為99%，菌株AP3系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖2。

圖2 基于假單胞菌屬內(nèi)16SrDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

從圖2中可以看到菌株AP3與菌株P(guān)seudomonas mosselii ATCCBAA－99聚到一起，親緣關(guān)系較近。根據(jù)形態(tài)觀察、生理生化和16SrDNA序列比對確定菌株AP3為Pseudomonas mosselii。假單胞菌屬是生物除磷的重要功能菌，其好氧聚磷和反硝化聚磷特征也有不少的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分離假單胞菌屬的聚磷菌作為研究對象，具有代表性，旨為大規(guī)模污水處理廠的工程化應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。

3.3 菌株AP3的厭氧聚磷特性

如圖3，菌株AP3在有Fe（Ⅲ）的培養(yǎng)基中比在無Fe（Ⅲ）的培養(yǎng)基中生長好。這是由于在厭氧條件下，菌株利用Fe（Ⅲ）作為呼吸鏈末端電子受體，氧化體內(nèi)的基質(zhì)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其生長發(fā)育和功能發(fā)揮所需的能量，從而使Fe（Ⅲ）還原為Fe（Ⅱ）。如圖4，菌株AP3在無Fe（Ⅲ）的培養(yǎng)基中，表現(xiàn)出典型的厭氧釋磷特征，前5h上清液磷濃度逐漸上升，菌內(nèi)磷濃度逐漸下降，釋磷量為3.68mg·L－1。在有Fe（Ⅲ）培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)中，菌株AP3先厭氧釋磷，上清液磷濃度增加，菌內(nèi)磷濃度下降，釋磷量為6.62mg·L－1，釋磷量比無Fe（Ⅲ）的高；10h之后開始厭氧聚磷，上清液磷濃度下降，菌內(nèi)磷濃度增加，聚磷量為5.89mg·L－1。

如圖5所示，在有菌培養(yǎng)基中Fe（Ⅱ）濃度逐步增加，增加量為4.39mg·L－1。在無菌對照組中，F(xiàn)e（Ⅱ）濃度較穩(wěn)定，平均為0.51mg·L－1。此現(xiàn)象表明，F(xiàn)e（Ⅲ）作為電子受體，被菌株異化還原為Fe（Ⅱ）。Fe（Ⅱ）濃度經(jīng)歷了一個(gè)由很緩慢變化到開始明顯增長的過程，這與水稻土中鐵的微生物還原特征相似，這主要是因?yàn)镕e（Ⅲ）成為厭氧條件下的主要電子受體以及微生物鐵還原活性的恢復(fù)都需要一定時(shí)間，即Fe（Ⅲ）的異化還原有一個(gè)啟動(dòng)期，因此Fe（Ⅱ）濃度在啟動(dòng)期內(nèi)只有微弱得增長。本實(shí)驗(yàn)中，啟動(dòng)期約10h，菌株AP3此時(shí)為厭氧釋磷，磷濃度上升。10h之后Fe（Ⅲ）的異化還原進(jìn)入快速期，菌株AP3厭氧吸磷，上清液磷濃度下降。該實(shí)驗(yàn)中上清液Fe（Ⅱ）濃度、菌體以及上清液磷濃度的變化規(guī)律初步證實(shí)了菌株AP3能以Fe（Ⅲ）為電子受體厭氧吸磷。

兩種培養(yǎng)基中均有磷酸鹽沉淀，整個(gè)培養(yǎng)過程中磷酸鹽沉淀略有變化，在有Fe（Ⅲ）的培養(yǎng)基中磷酸鹽沉淀比無Fe（Ⅲ）的培養(yǎng)基中略多。

圖3 菌OD值曲線

圖4 培養(yǎng)基上清液和菌體磷濃度曲線

圖5 培養(yǎng)基上清液Fe（Ⅱ）濃度曲線

已知生物除磷過程中，厭氧釋磷是好氧（或缺氧）超量聚磷的基礎(chǔ)，釋磷速度越快，整體除磷效果也越好。工程應(yīng)用中厭氧參數(shù)的主要控制指標(biāo)是厭氧池水力停留時(shí)間（AHRT），目前AHRT通常根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定，缺乏更深入的研究。不適當(dāng)?shù)腁HRT設(shè)置往往會(huì)造成生物除磷污水處理廠無法正常運(yùn)轉(zhuǎn)，從各地實(shí)踐和專家來看，仍然是不甚完美的工藝影響污水處理廠脫氮除磷效果。實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)e（Ⅲ）促進(jìn)聚磷菌的生長、厭氧釋磷和厭氧聚磷，在厭氧條件下，既有厭氧釋磷，又有厭氧吸磷。僅以經(jīng)驗(yàn)來確定厭氧時(shí)間是不夠的，建議采用釋磷情況的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，根據(jù)釋磷情況合理分配厭氧、好氧時(shí)間，利用這類菌和Fe（Ⅲ）的協(xié)同作用提高除磷脫氮效果。

生化協(xié)同除磷時(shí)，化學(xué)混凝沉淀與生物處理在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，化學(xué)試劑是否對污水生物處理系統(tǒng)性能產(chǎn)生影響成為國內(nèi)外相關(guān)研究人員關(guān)心的課題。但是，對化學(xué)絮凝藥劑的投加位點(diǎn)，通常只粗略的研究了前置、同步、后置投加，其中同步沉淀是應(yīng)用最廣泛的，但缺乏對其精確投藥位點(diǎn)的研究。因此，可以在該研究基礎(chǔ)上更為深入的研究除磷藥劑的投加方案，實(shí)現(xiàn)節(jié)能高效的達(dá)標(biāo)除磷。目前，異化Fe（Ⅲ）還原及其在污染治理中的作用受到關(guān)注［16］，可在該研究基礎(chǔ)上開發(fā)含鐵工業(yè)廢水再利用，鋼鐵工業(yè)的酸洗廢液是重要的FeCl3和FeSO4的來源，只要來源穩(wěn)定、純度滿足要求，就可通過以廢治廢，大幅度降低除磷費(fèi)用。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)分離得到具有厭氧聚磷現(xiàn)象的聚磷菌，根據(jù)形態(tài)觀察、生理生化和16SrDNA序列比對確定菌株AP3為Pseudomonas mosselii。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Fe（Ⅲ）促進(jìn)菌株AP3的生長和厭氧釋磷，菌株AP3能以Fe（Ⅲ）為電子受體厭氧聚磷。

研究初步揭示了菌株AP3能以Fe（Ⅲ）為電子受體厭氧聚磷的現(xiàn)象，為進(jìn)一步深入研究生物化學(xué)協(xié)同除磷和充分利用含鐵工業(yè)廢水實(shí)現(xiàn)高效低耗的城市污水處理提供了新的理論依據(jù)。

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