喙尾琵琶甲乙醇提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖的影響

張瀚丹，吳道勛，張海珠 ，李 楊

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000；3.大理大學學報編輯部，云南大理 671003）

肺纖維化是一種肺功能進行性喪失的嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，常出現(xiàn)干咳、呼吸困難等癥狀，隨著患病時間增加，患者的呼吸功能不斷惡化，患者的生存時間僅為2.8年，其死亡率高于大多數(shù)腫瘤〔1〕，引起醫(yī)護人員的廣泛關(guān)注。成纖維細胞異常增殖在肺纖維化形成過程中起重要作用〔2〕，肺成纖維細胞異常增殖后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，兩者分泌大量的細胞外基質(zhì)，形成肺纖維化。在肺纖維化過程中，大量的肺泡塌陷而形成密集的疤痕，最終導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)破壞，引起嚴重的呼吸困難。目前，臨床上常使用抗炎藥物與免疫抑制劑治療肺纖維化，但其并不能有效地抑制肺纖維化，并且增加了肺部的感染幾率，誘發(fā)呼吸衰竭〔3〕。因此，篩選安全、有效的抗肺纖維化藥物迫在眉睫。

喙尾琵琶甲（Blaps rynchopeteraFairmaire）屬鞘翅目（Coleoptera）擬步甲科（Tenebrionidae）琵琶甲屬（Blaps），是云南民間歷史悠久的藥用昆蟲，俗稱為臭屁蟲、臭殼子、咪多領(lǐng)等，具有良好的抗菌消炎、提高免疫功能以及抗腫瘤的功效〔4-7〕。云南彝族民間常用其治療發(fā)燒、咳嗽、胃炎、疔瘡、腫瘤等疑難雜癥〔4〕；傣族地區(qū)認為其具有清熱解毒、軟堅散結(jié)、消腫止痛的功效，可用于消除瘢痕〔5〕。瘢痕是由皮膚纖維母細胞增殖及凋亡平衡失調(diào)所導(dǎo)致的疾病〔8〕，趙文斌等〔9〕研究表明喙尾琵琶甲能有效地減少成纖維細胞，抑制兔耳增生性瘢痕，這與抑制成纖維細胞異常增殖而減輕肺纖維化相類似。目前的研究認為，活化的肺成纖維細胞是肺纖維化中的關(guān)鍵效應(yīng)細胞〔10〕，抑制肺成纖維細胞的增殖是治療肺纖維化的關(guān)鍵步驟〔2〕，因此，研究開發(fā)抑制肺成纖維細胞增殖的藥物是治療肺纖維化不可缺少的基礎(chǔ)。本實驗初步研究喙尾琵琶甲乙醇提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖的抑制，為開發(fā)有效的抗肺纖維化藥物提供基礎(chǔ)的實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

喙尾琵琶甲A、B、C提取物，人胚肺二倍體成纖維細胞（上海生物制品研究所），小牛血清（Gibco），RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco），二甲基亞砜（DMSO，Sigma），四甲基偶氮唑鹽試劑（Sigma），青霉素、硫酸鏈霉素（Amersco）；多功能酶標儀（BIO-Tek公司SN255939），倒置顯微鏡（OLYMPUS公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司3111），雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司SW-CJ-2F-D）。

2 方法

2.1 喙尾琵琶甲提取物溶液的配制 分別取喙尾琵琶甲干粉各5 g，分別加入90%乙醇、75%乙醇和60%乙醇50 mL，超聲提取30 min，過濾、濃縮、干燥。分別制成喙尾琵琶甲A、B、C提取物，提取率分別為1.19%、1.29%、1.96%。3種提取物用DMSO溶解至合適的濃度，作為儲備液于冰箱4℃保存。臨用前加入培養(yǎng)液制成所需濃度。

2.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組 人胚肺二倍體成纖維細胞從液氮中取出復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并加入青霉素100 U∕mL和鏈霉素 100 U∕mL，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗共設(shè)對照組，A、B、C提取物不同質(zhì)量濃度組（3.9、15.6、62.5、250.0、1 000.0 μg∕mL）。

2.3 MTT（噻唑藍）法測定喙尾琵琶甲提取物對細胞的增殖抑制作用 取對數(shù)生長期人胚肺二倍體成纖維細胞，以0.25%胰酶消化后，加入含小牛血清的培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清，再加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細胞，配成細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞密度為2×104個∕μL。以每孔100 μL細胞懸液接種入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)6個復(fù)孔，將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，使細胞同步。吸棄上清，按組加入含不同濃度3種提取物的培養(yǎng)液（血清含量為1%），并設(shè)對照組繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。于每一時間點分別取出培養(yǎng)板，加入5 g∕L的MTT溶液15 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL DMSO培養(yǎng)，振蕩10 min，于酶標儀490 nm波長處測定各孔吸光度（OD），以下式計算抑制率。抑制率=（1-OD對照∕OD測定）×100%。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0分析軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料均以（）表示，采用t檢測，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 A提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖抑制作用的影響 當A提取物的濃度為3.9 μg∕mL時，對人胚肺二倍體成纖維細胞的生長具有明顯的增殖作用；當濃度為15.6 μg∕mL時，隨著細胞孵育時間的延長，其對細胞增殖的抑制率逐漸減弱；當A提取物的濃度為62.5～1 000.0 μg∕mL時，其對細胞增殖具有明顯的抑制作用，并且隨著A提取物濃度和孵育時間的增加而加強。1 000.0 μg∕mL、72 h時，A提取物對細胞的抑制作用最佳，抑制率為49.87%。見表1。

表1 不同濃度A提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖抑制作用的影響（,n=6）

表1 不同濃度A提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖抑制作用的影響（,n=6）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

對照組3.9 15.6 62.5 250.0 1 000.0—-166.75 0.26 16.1 48.57 49.87 0.109 0±0.005 0 0.112 3±0.004 9 0.105 3±0.003 1 0.104 0±0.003 0 0.072 0±0.001 0**0.071 0±0.003 0**———0.275 1 0.154 5 0.062 0＜0.000 1＜0.000 1—-3.06 3.36 4.59 33.94 34.86 0.101 7±0.001 5 0.133 0±0.013 5*0.099 7±0.010 8 0.086 7±0.005 1**0.066 0±0.002 6**0.061 3±0.001 2**0.000 2 0.662 8＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1—-30.82 1.97 14.75 35.08 39.67 0.128 3±0.007 8 0.342 3±0.037 5**0.128 0±0.011 5 0.107 7±0.006 8**0.066 0±0.002 6**0.064 3±0.007 6**＜0.000 1 0.958 9 0.000 6＜0.000 1＜0.000 1

3.2 B提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖抑制作用的影響 當B提取物的濃度為3.9 μg∕mL時，對人胚肺二倍體成纖維細胞的生長具有一定的增殖作用；當B提取物的濃度為15.6 μg∕mL時，短時間內(nèi)，B提取物可以促進細胞的增殖，但是隨著B提取物與細胞孵育時間延長，其對細胞增殖出現(xiàn)一定的抑制作用；當B提取物的濃度為62.5～1 000.0 μg∕mL時，其對細胞增殖的抑制作用隨著B提取物濃度和孵育時間的增加而加強。1 000.0 μg∕mL、72 h時，B提取物對細胞的抑制作用最佳，抑制率為50.13%。見表2。

表2 不同濃度B提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖抑制作用的影響（,n=6）

表2 不同濃度B提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖抑制作用的影響（,n=6）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

對照組3.9 15.6 62.5 250.0 1 000.0—-15.84 5.45 18.96 38.96 50.13 0.109 0±0.005 0 0.114 0±0.003 0 0.113 7±0.001 5 0.108 3±0.001 5 0.077 3±0.002 5**0.070 3±0.001 5**———0.062 0 0.052 0 0.749 3＜0.000 1＜0.000 1—-4.59-4.28 0.61 29.05 35.47 0.101 7±0.001 5 0.116 3±0.003 2**0.099 7±0.001 2*0.086 3±0.001 2**0.072 0±0.011 5**0.062 3±0.003 2**＜0.000 1 0.028 8＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1—-14.43 3.93 15.08 29.18 38.69 0.128 3±0.007 8 0.148 7±0.001 5**0.121 3±0.003 8 0.104 0±0.010 0**0.078 3±0.005 7**0.064 0±0.002 0**＜0.000 1 0.076 4 0.000 9＜0.000 1＜0.000 1

3.3 C提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖抑制作用的影響 當C提取物的濃度為3.9～15.6 μg∕mL時，對人胚肺二倍體成纖維細胞的生長具有一定的增殖作用；當C提取物的濃度為62.5～1 000.0 μg∕mL時，其對細胞增殖具有顯著的抑制作用，并且隨著C提取物濃度和孵育時間的增加而加強。1 000.0 μg∕mL、72 h時，C提取物對細胞的抑制作用最佳，抑制率為42.34%。見表3。

表3 不同濃度C提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖抑制作用的影響（,n=6）

表3 不同濃度C提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖抑制作用的影響（,n=6）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

對照組3.9 15.6 62.5 250.0 1 000.0—-6.23-5.45 19.22 34.03 42.34 0.109 0±0.005 0 0.112 7±0.002 1 0.112 0±0.006 2 0.102 3±0.004 9*0.086 0±0.004 4**0.071 3±0.001 2**———0.125 6 0.379 9 0.041 0＜0.000 1＜0.000 1—-3.36-2.75 6.12 21.10 34.56 0.101 7±0.001 5 0.107 7±0.009 0 0.106 3±0.006 7 0.087 0±0.005 3**0.068 7±0.007 2**0.066 0±0.002 0**0.138 3 0.131 8＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1—-5.90-4.59 14.43 32.46 35.08 0.128 3±0.007 8 0.136 3±0.002 5*0.135 3±0.001 5 0.103 7±0.004 6**0.084 7±0.002 9**0.074 0±0.003 6**0.037 8 0.056 2＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1

4 討論

肺纖維化的發(fā)病機制復(fù)雜多樣，肺泡炎癥細胞的活化、浸潤以及肺成纖維細胞的異?；罨?、增殖、轉(zhuǎn)型以及分泌細胞外基質(zhì)共同導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生〔11〕。目前的研究認為：成纖維細胞異常增殖是肺纖維化進程中重要的病理特點，處于靜息狀態(tài)下的成纖維細胞受到刺激后過度增殖，引起細胞外基質(zhì)大量分泌、沉積而取代正常的肺組織，使肺結(jié)構(gòu)遭到破壞〔12-14〕，進而導(dǎo)致肺纖維化。肺纖維化嚴重威脅人類的生存質(zhì)量，同時引起人們的廣泛關(guān)注，但目前臨床上尚無治療肺纖維化的有效藥物。因此，以抑制肺成纖維細胞異常增殖為靶點而開展研究是開發(fā)防治肺纖維化藥物的有效方法。

低濃度的喙尾琵琶甲乙醇提取物促進肺成纖維細胞增殖，同時，高濃度的喙尾琵琶甲乙醇提取物對肺成纖維細胞的增殖具有抑制作用，這與施貴榮等〔6〕發(fā)現(xiàn)低濃度喙尾琵琶甲提取物在體外促進人腫瘤細胞株（K562、HL-60、A549）生長，而高濃度喙尾琵琶甲提取物抑制人腫瘤細胞株（K562、HL-60、A549）的生長相一致，但具體作用機制并不明確，需要進一步研究。喙尾琵琶甲乙醇提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖的抑制作用呈時間-劑量-效應(yīng)的依賴關(guān)系，并且具有長效的特點。當喙尾琵琶甲乙醇提取物的濃度為1 000.0 μg∕mL、72 h時，對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖的抑制效果最好，A、B、C提取物的抑制率分別為49.87%、50.13%、42.34%，3種提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞的抑制效果沒有較大差別，但是B提取物的抑制效果稍稍優(yōu)于A、C提取物。本研究只是涉及喙尾琵琶甲乙醇提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖抑制作用的初步研究，我們將選用B提取物進一步研究其對人胚肺二倍體成纖維細胞增殖抑制的機制，為開發(fā)安全、長效的抗肺纖維化藥物提供基礎(chǔ)的實驗依據(jù)。