肝龍膠囊對(duì)豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的治療作用

李 燕，邵明園，國(guó) 超，楊強(qiáng)麗，曹昌娥，賴 泳，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

肝纖維化是肝細(xì)胞持續(xù)性損傷導(dǎo)致機(jī)體炎癥、組織自我修復(fù)慢性激活的過(guò)程，若治療得當(dāng)或及早、及時(shí)治療可使肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)〔1-2〕；反之，則可發(fā)展為肝衰竭、肝硬化、肝癌〔3〕。隨著肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，胸腺、脾臟指數(shù)可有一定程度的降低；受損的肝臟充血、水腫、代償性增生、肥大等，肝臟指數(shù)隨之升高〔4-5〕。肝內(nèi)巨噬細(xì)胞在肝纖維化時(shí)產(chǎn)生大量的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1），促使肝星狀細(xì)胞（HSC）產(chǎn)生過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），引起ECM的主要成分Ⅰ型膠原（COL-Ⅰ）、層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）水平的上調(diào)〔5〕。參與肝細(xì)胞損傷、凋亡的自由基（ROS）可使γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）含量增加〔6〕，亦可激活HSC或促進(jìn)HSC分泌TGF-β1，而生物膜中的不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物丙二醛（MDA）可間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度〔7-8〕。

中藥治療肝纖維化對(duì)于減緩病情進(jìn)展具有積極的作用〔4〕，肝龍膠囊是由有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)美洲大蠊（俗稱“蟑螂”）研發(fā)而成的國(guó)家二類中藥新藥，具有抗病毒、抗氧化、防治慢性酒精性肝損傷、修復(fù)多種刺激所致的肝損傷及免疫調(diào)節(jié)的作用〔9-10〕。課題組前期研究結(jié)果表明肝龍膠囊能顯著降低豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟中COL-ⅠmRNA、TIMP-ⅠmRNA的表達(dá)水平，且臨床上肝纖維化非創(chuàng)性早期診斷主要通過(guò)檢測(cè)與ECM生成相關(guān)的物質(zhì)（HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ）的代謝水平、細(xì)胞因子TGF-β1、γ-GT指標(biāo)來(lái)反映肝纖維化及其程度，所以本文通過(guò)豬血清大鼠模型觀察肝龍膠囊在抗肝纖維化治療中對(duì)臟器指數(shù)、LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1、γ-GT、MDA指標(biāo)的影響，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試劑 水飛薊賓膠囊（天津天士力圣特制藥有限公司，批號(hào)：16041601）；肝龍膠囊（昆明賽諾制藥有限公司，批號(hào)：550706087）；豬血清（北京燕生政博生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：20210922）；冰醋酸（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20130114）；異氟烷（力諾集團(tuán)山東科源制藥股份有限公司，批號(hào)：131102）；COL-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA測(cè)試盒，TGF-β1試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20161220）；γ-GT、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20161223、201612237）。

1.2 材料 SD雄性健康成年大鼠，體質(zhì)量160～200g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（湘）2011-0003；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，型號(hào)：ML204∕02）；酶標(biāo)儀（奧地利安圖斯公司，型號(hào)：201）；臺(tái)式離心機(jī)（上海離心機(jī)械研究所，型號(hào)：TL-16R）。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白組、模型組、水飛薊賓膠囊組（7 mg∕kg）、肝龍膠囊高劑量組（120 mg∕kg）、肝龍膠囊中劑量組（60 mg∕kg）、肝龍膠囊低劑量組（30 mg∕kg），共6組，每組8只。空白組正常飼養(yǎng)，其余各組用未滅活豬血清腹腔注射，每次0.5 mL∕只，2次∕周，連續(xù)10周。為維持病因刺激和避免模型自然恢復(fù)，治療期間仍每天腹腔注射1次豬血清，每只注射0.6 mL。

1.3.2 給藥 10周造模結(jié)束后，空白對(duì)照組：給予蒸餾水灌胃，0.5 mL∕100 g；水飛薊賓膠囊組：7 mg∕kg，3次∕d；肝龍膠囊高劑量組：120 mg∕kg，2次∕d；肝龍膠囊中劑量組：60 mg∕kg，2次∕d；肝龍膠囊低劑量組：30 mg∕kg，2次∕d。給藥容量均為0.5 mL∕100 g。

1.3.3 樣本采集與處理 末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h。稱重、記錄，用異氟烷使大鼠吸入麻醉，立即剖開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血。血液靜置4 h后，以3 000 r∕min的速度離心5 min后，取上層血清，根據(jù)各個(gè)待測(cè)指標(biāo)所需的量分裝后，放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。暴露并取出肝臟、脾臟、胸腺于冰生理鹽水中洗滌，濾紙吸干水分，稱重、記錄并分裝于自封袋中，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 生化指標(biāo)的檢測(cè) 將血清、肝臟組織上清液從-80℃冰箱取出，-20℃冰箱過(guò)夜后，4℃冰箱解凍，檢測(cè)前常溫放置待用。所有檢測(cè)指標(biāo)（LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1、γ-GT、MDA）按各自試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察 大鼠造模前：所有大鼠活潑好動(dòng)，精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，飲食正常。造模期間：各組大鼠的平均體質(zhì)量均呈逐漸上升趨勢(shì)，從第5周開(kāi)始空白組較造模組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)快，造模前后兩組大鼠體質(zhì)量增加比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；從第6周開(kāi)始，造模組大鼠精神萎靡、嗜睡、毛發(fā)不整且無(wú)光澤，小便顏色較空白組的黃，大便較空白組大鼠更軟；給藥后：大鼠精神狀態(tài)改善，脫毛現(xiàn)象減輕，大小便顏色逐漸恢復(fù)正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)與空白組差異變小。

2.2 肝龍膠囊對(duì)豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)的影響 與空白組相比，模型組大鼠肝重指數(shù)、脾重指數(shù)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與空白組相比，模型組大鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，肝龍膠囊給藥組脾重指數(shù)、胸腺指數(shù)升高，中、高劑量組升高明顯（P＜0.05）；肝龍膠囊給藥組體質(zhì)量、肝重指數(shù)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量增加、肝指數(shù)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)比較表（）

表1 各組大鼠體質(zhì)量增加、肝指數(shù)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)比較表（）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05 ，▲▲P＜0.01 。

空白組模型組水飛薊賓膠囊組肝龍膠囊0.55±0.19 0.48±0.17 0.74±0.27 0.64±0.11**1.08±0.51**▲▲1.00±0.25▲▲■■■■■低劑量組中劑量組高劑量組225.43±19.01 193.44±21.58 174.36±27.23*219.36±42.37 159.57±6.36*175.58±58.84*2.46±0.14 3.05±0.25**2.96±0.12**2.97±0.28**3.31±0.23**3.04±0.24**1.60±0.16 3.28±0.23**3.33±0.53**3.56±0.26**7.63±1.58**▲▲4.80±2.20**▲

2.3 肝龍膠囊對(duì)豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量的影響與空白組相比，模型組大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量均升高（P＜0.05）；模型組大鼠血清COL-Ⅰ、TGF-β1含量與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，肝龍膠囊低劑量組使大鼠血清中LN、TGF-β1、PCⅢ、Ⅳ-C含量降低（P＜0.05）；肝龍膠囊中、高劑量組大鼠血清中LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；肝龍膠囊給藥組大鼠肝組織COL-Ⅰ含量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

表2 各組大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.4 肝龍膠囊對(duì)豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量的影響與空白組比較，模型組大鼠肝組織HA、Ⅳ-C含量升高（P＜0.05）；與空白組比較，模型組大鼠肝組織LN、PCⅢ、COL-Ⅰ、TGF-β1含量與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，肝龍膠囊給藥組使大鼠肝組織LN含量降低（P＜0.01）；與模型組比較，肝龍膠囊中劑量組使大鼠肝組織HA含量降低（P＜0.05）；肝龍膠囊低、高劑量組使大鼠肝組織HA含量升高，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，肝龍膠囊低、高劑量組使大鼠肝組織Ⅳ-C含量降低（P＜0.01）；肝龍膠囊中劑量組使大鼠肝組織Ⅳ-C含量升高，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，肝龍膠囊中、高劑量組使大鼠肝組織COL-Ⅰ含量升高（P＜0.05）；肝龍膠囊低劑量組使大鼠肝組織COL-Ⅰ含量降低，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，肝龍膠囊低劑量組使大鼠肝組織TGF-β1含量降低（P＜0.05）；肝龍膠囊中劑量組使大鼠肝組織TGF-β1含量升高，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；肝龍膠囊給藥組大鼠肝組織PCⅢ含量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

2.5 肝龍膠囊對(duì)豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織γ-GT、MDA含量的影響 模型組大鼠肝組織γ-GT、MDA含量與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，肝龍膠囊給藥組使大鼠肝組織γ-GT含量降低，其中低、高劑量組與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；肝龍膠囊給藥組大鼠肝組織MDA含量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表3 各組肝臟組織LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

表3 各組肝臟組織LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 ；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 。

空白組模型組水飛薊賓膠囊組肝龍膠囊646±136.57 800.33±193.85 631.25±62.38 467.85±213.81▲▲629.88±250.00 590.76±129.71■■■■■低劑量組中劑量組高劑量組16.19±1.19 30.97±8.70**20.74±2.41*▲▲31.15±2.52**24.84±1.07**▲33.91±4.52**540±38.38 597±52.08 528.63±80.38▲484.77±52.63▲▲312.57±55.63**▲▲305.75±47.79**▲▲73.54±4.97 63.15±11.15 49.32±13.07*▲65.91.±8.79 71.19±13.27 64.62±12.45 110.83±6.50 209.01±138.35*65.34±2.45▲▲106.69±1.72▲▲243.72±56.07*82.75±5.41▲▲11.99±8.69 23.10±2.28 17.51±10.37 20.00±3.76 42.79±15.52**▲41.77±4.31**▲

表4 各組肝臟組織γ-GT、MDA含量（，n=8）

表4 各組肝臟組織γ-GT、MDA含量（，n=8）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道，豬血清以異種抗原的身份侵入，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使機(jī)體呈現(xiàn)主動(dòng)的肝纖維化，或作為炎癥因子，刺激機(jī)體釋放細(xì)胞因子，激活HSC，使ECM過(guò)度沉積引起肝纖維化〔8〕。其誘導(dǎo)的肝纖維化模型在存在較小的肝細(xì)胞損傷、模型持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、自愈率低、對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響小、對(duì)動(dòng)物整體損傷輕微等特點(diǎn)的同時(shí)，具有強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答能力，其纖維化發(fā)生機(jī)制與臨床上慢性肝炎所致肝纖維化接近〔11-12〕。因此，采用豬血清誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型。肝纖維化時(shí)，ECM增生、沉積的主要成分是COL-Ⅰ、PCⅢ；由間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的糖胺聚糖HA反映肝纖維化和肝損傷；基底膜的主要成分LN、Ⅳ-C在基底膜增生、肝竇毛細(xì)血管化過(guò)程中含量增加〔13〕。5種標(biāo)記物是不同類型的蛋白質(zhì)，其增加的機(jī)制也不同，因此，幾個(gè)標(biāo)記物的聯(lián)合測(cè)試具有扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。與空白組比較，模型組大鼠血清及肝臟組織各指標(biāo)除MDA外，其余指標(biāo)的含量均高于空白組，是因?yàn)樨i血清通過(guò)MHCⅡ類分子和炎癥分子激活HSC轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞（MFB），表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），使肝臟內(nèi)免疫細(xì)胞釋放免疫調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞因子，導(dǎo)致ECM過(guò)度沉積，LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ水平上調(diào)，導(dǎo)致肝功能降低，肝功能指標(biāo)∕肝纖維化間接標(biāo)志物γ-GT含量增加、肝臟生理結(jié)構(gòu)被破壞，從而形成肝纖維化〔14-15〕；MDA含量未發(fā)生變化與豬血清對(duì)肝細(xì)胞的損傷小，使自由基不能作用于脂質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激過(guò)量產(chǎn)生ROS（活性氧類）有關(guān)。

脾臟、胸腺是機(jī)體的免疫器官，其臟器指數(shù)的高低與免疫功能的強(qiáng)弱、免疫活性細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)。肝龍膠囊給藥組脾重指數(shù)、胸腺指數(shù)高于模型組，且胸腺增重一般被認(rèn)為可能有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，故提示肝龍膠囊可提高機(jī)體的免疫力。肝重指數(shù)與模型組比較有輕微的增高或降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且給藥組大鼠體質(zhì)量均低于模型組的同時(shí)并未做病理檢測(cè)，可能是體質(zhì)量的降低造成臟器指數(shù)的假陽(yáng)性增高或降低，所以并不能說(shuō)明肝臟是否有增生、充血、肥大等現(xiàn)象。

TGF-β1促進(jìn)肝纖維化有3種途徑：首先，TGF-β1抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）或促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）表達(dá)，抑制ECM降解；其次，TGF-β1通過(guò)管狀細(xì)胞誘導(dǎo)MFB形成上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）；最后，TGF-β1通過(guò)Smad3依賴或Smad非依賴途徑誘導(dǎo)機(jī)制產(chǎn)生〔16〕。受損肝細(xì)胞刺激引起巨噬細(xì)胞所分泌的TGF-β1與胞膜上的TGF-β1Ⅱ（TβRⅡ）結(jié)合，磷酸化的TβRⅡ激活TβRⅠ，活化的TβRⅠ與Smad2∕3結(jié)合，使COL-Ⅰ產(chǎn)生，從而形成肝纖維化〔11，17〕。而Smad蛋白是TGF-β1的關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)物，在抗肝纖維化方面，Smad2直接下調(diào)COL-Ⅰ表達(dá)，或由TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護(hù)型Smad7通過(guò)抑制TβRⅠ與Smad2∕3的結(jié)合阻斷TGF-β1的過(guò)度激活，從而下調(diào)COL-Ⅰ表達(dá)；在促肝纖維化方面，Smad3直接上調(diào)COL-Ⅰ的表達(dá)，或Smad4通過(guò)調(diào)節(jié)Smad3上調(diào)COL-Ⅰ的表達(dá)，亦使ECM過(guò)度沉積。藥物治療組大鼠血清和肝臟組織中TGF-β1的含量及大鼠肝臟組織LN含量在一定程度上均低于模型組，提示各藥物治療都起到一定的作用。曾有文獻(xiàn)報(bào)道〔18〕，肝龍膠囊抗肝纖維化可能與降低肝纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)，所以可以解釋大鼠肝臟組織LN含量的降低。肝龍膠囊給藥組對(duì)大鼠肝組織PCⅢ無(wú)影響的同時(shí)會(huì)使COL-Ⅰ的含量增加，表明肝龍膠囊抗肝纖維化的作用機(jī)制與PCⅢ、COL-Ⅰ無(wú)關(guān)。

治療組中其余各指標(biāo)對(duì)模型組升高的指標(biāo)不呈線性關(guān)系，有的還顯示某一濃度降低而其余濃度對(duì)其無(wú)影響的結(jié)果，推測(cè)可能的原因是肝龍膠囊對(duì)肝纖維化大鼠中升高的各個(gè)指標(biāo)都有不同的適宜的治療濃度范圍，當(dāng)濃度超過(guò)或低于一定范圍時(shí)，肝龍膠囊對(duì)其就沒(méi)有作用或起相反的作用。對(duì)于以上結(jié)果，可以考慮與其他藥物聯(lián)合使用，以此為臨床治療提供更好的治療方案。