二代測(cè)序技術(shù)在兒童T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤全外顯子測(cè)序中的應(yīng)用

姚新原，溫賢浩，憲 瑩，朱 進(jìn)，肖劍文，3

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤中心；2兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014

T細(xì)胞性淋巴母細(xì)胞淋巴瘤（T-LBL）和T細(xì)胞性急性淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）均是起源于不成熟前體T淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤，一般以骨髓原始及幼稚淋巴細(xì)胞≥25%診斷T-ALL，而＜25%或骨髓未受累診斷T-LBL[1]。各種理化、遺傳因素引發(fā)的DNA損傷所導(dǎo)致的體細(xì)胞突變是T-LBL發(fā)病的重要因素及腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記，文獻(xiàn)報(bào)道體細(xì)胞突變的腫瘤標(biāo)記（如NOTCH1、FBXW7等）與T-ALL及T-LBL預(yù)后相關(guān)[2-3]。既往多采用PCR擴(kuò)增后一代測(cè)序（Sanger測(cè)序）技術(shù)檢測(cè)腫瘤基因突變，但檢測(cè)到的基因突變種類(lèi)且靈敏度不高[2]。全外顯子組是致病突變最為集中的區(qū)域，因此在T-LBL患兒樣本中開(kāi)展全外顯子測(cè)序（WES）檢測(cè)腫瘤細(xì)胞存在的基因突變，可以一次性檢測(cè)到目前全部已知的腫瘤基因突變，也可用于定期隨訪(fǎng)其治療后特異性腫瘤基因突變水平和殘留病灶監(jiān)測(cè)[4]，對(duì)于T-LBL治療具有重大指導(dǎo)意義。但如果采用常規(guī)的Sanger測(cè)序技術(shù)進(jìn)行WES測(cè)序費(fèi)用高且耗時(shí)長(zhǎng)，根本不能應(yīng)用于臨床診療。二代測(cè)序技術(shù)（NGS）大幅度提高了外顯子組測(cè)序的速度和測(cè)序量而檢測(cè)費(fèi)用顯著降低，使得腫瘤患者組織標(biāo)本的常規(guī)WES檢測(cè)成為可能[5]。

T-ALL患兒可采集骨髓標(biāo)本提取基因組DNA進(jìn)行NGS測(cè)序檢查，而T-LBL病理標(biāo)本多采用福爾馬林固定后石蠟包埋保存，故難以獲得新鮮腫瘤組織提取基因組DNA進(jìn)行NGS檢測(cè)，尤其是已經(jīng)保存較長(zhǎng)時(shí)間的樣本基因組DNA存在不同程度的降解，更是增加了檢測(cè)難度。本研究從10例T-LBL患兒石蠟包埋組織切片中提取基因組DNA，進(jìn)行基于NGS技術(shù)的全外顯子組測(cè)序并用于探索T-LBL患兒的體細(xì)胞突變，為進(jìn)一步研究應(yīng)用WES測(cè)序檢測(cè)腫瘤基因突變打下基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入2013年3月～2017年6月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液科住院治療的10例T-LBL患兒作為研究對(duì)象，其中男性6例，女性4例，年齡82.70±12.27月。10例患兒均行淋巴結(jié)活檢確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷時(shí)年齡均＜18歲；（2）按照WHO-2008造血及淋巴組織腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)完善檢查且符合T-LBL診斷[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）骨髓原始及幼稚淋巴細(xì)胞比例≥25%；（2）既往接受過(guò)抗腫瘤治療：（3）繼發(fā)性腫瘤患兒。所有淋巴結(jié)活檢標(biāo)本均經(jīng)過(guò)福爾馬林固定后石蠟包埋、室溫存放。

1.2 方法

1.2.1 石蠟包埋組織處理 每例石臘固定標(biāo)本均連續(xù)切片5～10張，厚度為5 μm。二甲苯脫蠟2次（40 ℃水浴，時(shí)間12～24 h）后無(wú)水乙醇漂洗2次，離心5 min去上清液并真空干燥。加入1000 μg/mL蛋白酶K細(xì)胞裂解液（50 ℃水浴，12～24 h）處理后收集細(xì)胞，PBS洗滌并離心，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后收集細(xì)胞懸液。

上述步驟所得細(xì)胞懸液利用基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood MiniKit，Qiagen）提取樣本DNA，方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。所提取DNA使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260及A280，A260/A280值1.6～1.8為合格樣本，-20 ℃保存基因組DNA樣本。

1.2.2 全外顯子組測(cè)序 全外顯子組測(cè)序委托上海新培晶醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所完成。每例患兒取15～20 μg基因組DNA樣本，采用超聲打斷儀（Covaris s2，Massachusetts，USA）將基因組DNA隨機(jī)打斷成主代200 bp左右片段，取1 μg提純的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)并連接上標(biāo)記性接頭，構(gòu)建DNA測(cè)序文庫(kù)。按照illumina標(biāo)準(zhǔn)建庫(kù)方法行3步酶促反應(yīng)形成樣本文庫(kù)[7]。

序列捕獲采用羅氏全外顯子液相芯片（NimbleGen SeqCap EZ Exome V3 芯片，Roche，64 M）并按照供應(yīng)商提供的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行[8]，混合后的文庫(kù)在42 ℃條件下雜交16～20 h。然后進(jìn)行洗脫、純化后PCR擴(kuò)增即得到序列捕獲后的產(chǎn)物，上機(jī)測(cè)序（Illumina HiSeq ×10），平均測(cè)序深度150～200×。

1.2.3 全外顯子組數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析 用Illumina Pipeline software（version1.3.4）讀出原始測(cè)序數(shù)據(jù)，首先進(jìn)行包括圖像識(shí)別、堿基識(shí)別、過(guò)濾接頭序列和檢測(cè)可能的樣本污染等基本數(shù)據(jù)處理，然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。生物信息學(xué)及突變分析方法為：GATK、SAMTools、SIFT、PolyPhen2、LRT、Mutation-Taster等。主要步驟包括：處理后數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)，找到單一比對(duì)到基因組上數(shù)據(jù)序列，將其與外顯子組區(qū)域再比對(duì)，隨后進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域中單堿基深度分布和覆蓋度均一性分析。突變數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源包括：1000 Genomes Project、dbSNP、ClinVar、ESP6500、ExAc、Ensembl、HGMD、UCSC等。同時(shí)應(yīng)用SIFT在線(xiàn)預(yù)測(cè)工具（http://sift.icvi.org/）和Polyphen-2軟件預(yù)測(cè)突變對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。

對(duì)于發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)結(jié)合文獻(xiàn)[2，9-12]及軟件分析結(jié)果，將突變區(qū)分為以下4類(lèi)：（1）文獻(xiàn)報(bào)道與疾病明確相關(guān)的突變位點(diǎn)；（2）與疾病可能相關(guān)的突變位點(diǎn)；（3）意義不明確的變異位點(diǎn)；（4）無(wú)致病性變異位點(diǎn)。（1）+（2）兩類(lèi)突變被認(rèn)為是致病基因候選突變位點(diǎn)。

1.2.4 致病突變位點(diǎn)Sanger測(cè)序 測(cè)序所得致病候選突變位點(diǎn)，通過(guò)http://www.ncbi.nih.gov/查詢(xún)到相應(yīng)基因的GeneBank外顯子序列、采用Gene Tool軟件對(duì)每個(gè)候選突變區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由生工生物工程股份（上海）有限公司合成。以基因組DNA為模板，擴(kuò)增目的DNA片段，所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化及鑒定后，加入BigDye? Terminator v3.1（ABI）進(jìn)行PCR擴(kuò)增并上機(jī)測(cè)序，與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的mRNA標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，進(jìn)行突變位點(diǎn)鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

10例患兒測(cè)序結(jié)果的突變數(shù)、與疾病相關(guān)突變數(shù)、測(cè)序深度使用SPSS 19.0進(jìn)行列表分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，中位水平采用中位數(shù)（范圍）表示。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取

10例石蠟包埋組織樣本切片厚度5 μm且每例組織樣品切片5張以上，每張切片經(jīng)基因組DNA提取，均成功提取到基因組DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，所獲得的基因組DNA樣本均質(zhì)量良好，且數(shù)量足夠完成本研究、留取標(biāo)本復(fù)核及建立組織樣本庫(kù)為后續(xù)研究做準(zhǔn)備。

2.2 外顯子組測(cè)序結(jié)果

采用羅氏全外顯子液相芯片對(duì)10例T-LBL患兒進(jìn)行外顯子組捕獲及測(cè)序，總體測(cè)序深度為182.73±69.89，中位測(cè)序深度165.19（89.52～347.28）。測(cè)序輸出的原始數(shù)據(jù)與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中的外顯子基因組序列進(jìn)行比對(duì)，得到與致病相關(guān)的突變位點(diǎn)序列。通過(guò)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)10例患兒每例均有突變，例均突變數(shù)34.20±9.90，10例患兒中位突變數(shù)32（20～48）。每例患兒均發(fā)現(xiàn)潛在致病突變（表1），例均疾病相關(guān)突變2.30±1.06，10例患兒疾病相關(guān)突變中位數(shù)2（1-5）。上述疾病相關(guān)突變涉及基因合計(jì)16種，其中文獻(xiàn)報(bào)道[9-12]與疾病明確相關(guān)的突變基因共10種，包括：JAK3、FBXW7、ETV6、CDKN1B、NOTCH1、BCOR、DMBT1、NF1、PHF6和KMT2D，與疾病可能相關(guān)的突變基因[13-15]共6種，包括：TSC1、CDH1、FLG、SMARCA4、RASA2和USH2A。所有致病突變經(jīng)過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證均確實(shí)存在于患兒基因組。

表1 10例T-LBL患者疾病相關(guān)基因突變

3 討論

T-LBL是兒童期非霍奇金淋巴瘤的常見(jiàn)亞型，DNA損傷導(dǎo)致的體細(xì)胞突變是包括T-LBL在內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞特異的分子生物學(xué)標(biāo)記[16]。初診時(shí)確定腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)記可以指導(dǎo)治療方案選擇及判斷預(yù)后，如FBXW7陽(yáng)性T-LBL預(yù)后較差，可能需要采用異基因造血干細(xì)胞移植在內(nèi)的強(qiáng)化治療方案[2]。本研究中10例患兒經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)多種腫瘤相關(guān)基因變異，其中JAK3[16]，NOTCH1[2]，ETV6[16]等基因均報(bào)道與血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)生相關(guān)，而FBXW7則是T-LBL中常見(jiàn)與預(yù)后密切相關(guān)且對(duì)臨床診療方案具有指導(dǎo)意義的基因。

U-淋巴瘤經(jīng)過(guò)治療后體內(nèi)仍剩余有腫瘤細(xì)胞，即微小擴(kuò)散病灶[17]，治療后微小擴(kuò)散病灶水平為判斷治療反應(yīng)、危險(xiǎn)度分級(jí)以及指導(dǎo)進(jìn)一步化療、指導(dǎo)造血干細(xì)胞移植指征選擇等提供了一個(gè)客觀直接的量化指標(biāo)，是淋巴瘤獨(dú)立的預(yù)后因素[18]，既往主要采用CT、PET-CT等影像學(xué)檢測(cè)方法評(píng)估淋巴瘤微小擴(kuò)散病灶水平，但其靈敏度及特異性均較低[19]，如果病初確定T-LBL標(biāo)志性的腫瘤突變，治療后采集外周血檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA，可以為指導(dǎo)治療提供更加靈敏可靠的監(jiān)測(cè)手段[20]。本研究隊(duì)列中10例患兒均發(fā)現(xiàn)疾病潛在相關(guān)突變，平均為2.30（1～5）個(gè)，提示基因組疾病相關(guān)突變對(duì)于微小擴(kuò)散病灶分析具有潛在價(jià)值。但本文未對(duì)患兒正常組織進(jìn)行測(cè)序分析，尚不能分辨上述潛在突變系遺傳突變還是體細(xì)胞突變，隨訪(fǎng)過(guò)程中需要對(duì)正常組織測(cè)序以進(jìn)一步確定上述變異是否為腫瘤細(xì)胞特異性改變，明確其微小擴(kuò)散病灶監(jiān)測(cè)價(jià)值。

有研究認(rèn)為T(mén)-LBL和T-ALL系相同疾病的不同表現(xiàn)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)20種腫瘤標(biāo)記與T-LBL/TALL發(fā)病及預(yù)后有關(guān)[9-12]。診斷為T(mén)-ALL的患者骨髓中存在大量腫瘤細(xì)胞，采集骨髓液提取基因組DNA可進(jìn)行測(cè)序分析，但目前國(guó)內(nèi)診斷為T(mén)-LBL患者病理標(biāo)本多采用福爾馬林固定后行石蠟包埋，故難以獲得保存良好的新鮮腫瘤組織，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，基因組DNA不斷破壞，限制了腫瘤細(xì)胞突變的檢測(cè)[21]。本研究對(duì)一個(gè)10例T-LBL的包埋樣本進(jìn)行了WES分析，分析結(jié)果表明樣本可以用于測(cè)序分析，且能夠達(dá)到理想的測(cè)序深度用于后續(xù)基因組數(shù)據(jù)分析。同時(shí)，測(cè)序結(jié)果表明所有患兒均具有腫瘤相關(guān)基因突變，人均2.30個(gè)，較常見(jiàn)B細(xì)胞類(lèi)群淋巴瘤為少，而與兒童白血病接近，NOTCH1，PHF-6以及FBXW7等基因也為T(mén)-ALL常見(jiàn)突變基因，均提示該類(lèi)樣本W(wǎng)ES分析的可靠性較高，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

T-LBL體細(xì)胞突變類(lèi)型較多，傳統(tǒng)的基因突變檢測(cè)系采用Sanger測(cè)序法逐一檢測(cè)致病突變，該方法耗時(shí)費(fèi)力、費(fèi)用較高，且不能發(fā)現(xiàn)新的致病突變[22]。多數(shù)腫瘤的致病突變集中在僅占全基因組不到2%的各基因外顯子編碼區(qū)序列，對(duì)編碼區(qū)序列檢測(cè)即為WES[23]。隨著新一代測(cè)序技術(shù)NGS的發(fā)展，WES測(cè)序效率得到顯著提高測(cè)序成本不斷下降[24-25]，為采用NGS對(duì)T-LBL進(jìn)行WES檢測(cè)提供了可能。本研究中發(fā)現(xiàn)的基因變異，除了常見(jiàn)于T-LBL的突變基因NOTCH1，F(xiàn)BXW7，PHF6等以外，更是發(fā)現(xiàn)多種腫瘤相關(guān)基因突變，且均為錯(cuò)義、移碼等突變類(lèi)型，具有功能意義，對(duì)于臨床有重要提示作用。

本研究在國(guó)內(nèi)首次采用石蠟包埋的T-LBL病理組織提取基因組DNA，并使用NGS技術(shù)對(duì)10例TLBL患兒行WES測(cè)序，建立了標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方案。通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)WES測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析并確定致病突變位點(diǎn)后，采用Sanger測(cè)序進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果顯示本研究采用的檢測(cè)方案可以高效的檢測(cè)出T-LBL致病位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究T-LBL發(fā)病機(jī)制及治療打下基礎(chǔ)。