鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ基因沉默的乳鼠肥大心室肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流和動(dòng)作電位的變化

扶澤南，楊龍，夏桂玲，何炯紅，黃勇淇，田野

(1貴州省人民醫(yī)院·貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院，貴陽(yáng)550002)

心肌異常肥大導(dǎo)致的心室重構(gòu)是慢性充血性心力衰竭(CHF)最主要的發(fā)生機(jī)制[1]。CHF患者最主要的死亡原因?yàn)樾呐K性猝死(SCD)[2]。心室肌細(xì)胞離子通道重構(gòu)是導(dǎo)致細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程(APD)改變，進(jìn)而引發(fā)惡性室性心律失常的重要病理生理基礎(chǔ)[3,4]。內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)參與動(dòng)作電位復(fù)極后期進(jìn)程，具有穩(wěn)定心肌細(xì)胞靜息電位、保障心臟復(fù)極儲(chǔ)備的作用。研究[5,6]發(fā)現(xiàn)，編碼Ik1離子通道α亞基的Kir2.1基因突變可導(dǎo)致長(zhǎng)、短QT綜合征。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)是迄今所知的惟一一種受Ca2+/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，廣泛分布于機(jī)體各種組織中,參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并通過(guò)作用于不同的底物而產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。CaN的活化可促進(jìn)心肌肥厚性重構(gòu)和心力衰竭，導(dǎo)致心律失常性死亡[7]；CaN的活性改變影響肥大心肌細(xì)胞離子通道的重構(gòu)[8～10]。目前關(guān)于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ亞基(CnAβ)在CHF中的具體作用機(jī)制相關(guān)研究報(bào)道較少。2016年11月～2017年12月，我們觀察了CnAβ基因沉默的乳鼠肥大心室肌細(xì)胞Ik1及動(dòng)作電位的變化，旨在為CnAβ在CHF發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑 清潔級(jí)1 d齡SD乳鼠60只，雌雄不限，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)[SYXK(京)2011-0039]。膜片鉗放大器及數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器(美國(guó)Axon公司)，兔抗大鼠CnAβ抗體(德國(guó)Merck Millipore公司)，Ⅱ型膠原酶和胰酶(美國(guó)Sigma公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基、特優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS)、苯腎上腺素(PE)和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)為美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)，重組腺病毒shRNA干擾載體介導(dǎo)沉默編碼CnAβ的基因(Ad-CnAβshRNA1，簡(jiǎn)寫(xiě)A1，5′-CAGAAAGGGTCTATGAAGCTTGTAT-3′)及腺病毒空載體由漢恒生物科技(上海)有限公司包裝制備。

1.2 乳鼠心室肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)及肥大刺激方法 取乳鼠，乙醚麻醉，開(kāi)胸取心臟，分離心室并剪碎。酶解法分離細(xì)胞，差速貼壁結(jié)合5-BrdU培養(yǎng)獲得心室肌細(xì)胞，37 ℃ 、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，換無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心室肌細(xì)胞，加入終濃度100 μM的PE刺激培養(yǎng) 48 h，RT-qPCR法測(cè)定細(xì)胞肌球蛋白重鏈β(β-MHC，上游引物序列5′-CAAGGAGCTCACCTACCAGA-3′，下游引物序列5′-CAGCTTGTTGACCTGGGACT-3′)、腦鈉尿肽(BNP，上游引物序列5′-GTCTCCAGAACAATCCACGA-3′，下游引物序列：5′-CTAAAACAACCTCAGCCCGT-3′)[10]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與刺激前比較，PE刺激48 h時(shí)心室肌細(xì)胞BNP、β-MHC的mRNA相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，說(shuō)明PE可導(dǎo)致心室肌細(xì)胞肥大[10]。

1.3 心室肌細(xì)胞分組及CnAβ基因沉默方法 取心室肌細(xì)胞，分為A、B、C、D組。A組加入MOI=50對(duì)應(yīng)量的腺病毒空載體，感染6 h時(shí)更換成2倍體積新鮮無(wú)血清DMEM，培養(yǎng)48 h。B組加入MOI=50對(duì)應(yīng)量的腺病毒空載體，感染6 h換為2倍體積新鮮無(wú)血清DMEM，感染24 h時(shí)加入終濃度為100 μmol/L 的PE，培養(yǎng)48 h。C組加入MOI=50對(duì)應(yīng)量的A1，感染6 h時(shí)換成2倍體積新鮮無(wú)血清DMEM，培養(yǎng)48 h。D組加入MOI=50對(duì)應(yīng)量的A1，感染6 h時(shí)換成2倍體積新鮮無(wú)血清DMEM，感染24 h時(shí)加入終濃度為100 μmol/L 的PE，培養(yǎng)48 h。

1.4 各組心室肌細(xì)胞CnAβ蛋白檢測(cè)方法 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞檢測(cè)心肌細(xì)胞CnAβ蛋白[10]。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以目的條帶的灰度值代表CnAβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各組心室肌細(xì)胞Ik1及動(dòng)作電位變化觀察 采用全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞，在電壓鉗模式下記錄各組Ik1，計(jì)算電流密度(pA/pF)=電流強(qiáng)度/電容。Ik1超極化階躍方案：將鉗制電壓設(shè)置為-40 mV，-140 mV～-40 mV系列脈沖刺激，躍階電壓10 mV，波寬600 ms，頻率0.1 Hz的刺激。電流鉗模式下記錄AP，給予1 nA電流脈沖，波寬2.5 ms，引發(fā)心室肌細(xì)胞AP。記錄并分析動(dòng)作電位復(fù)極20%、50%和90%(APD20、APD50、APD90)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組心室肌細(xì)胞CnAβ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 A、B、C、D組心室肌細(xì)胞CnAβ蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.01、2.59±0.30、1.00±0.16、0.82±0.16，與A組比較，B組心室肌細(xì)胞CnAβ蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05；n=3)；與B組比較，C組心室肌細(xì)胞CnAβ蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05；n=3)。

2.2 各組心室肌細(xì)胞Ik1變化比較 各組心室肌細(xì)胞Ik1變化見(jiàn)表1，Ik1電流-電壓圖見(jiàn)圖1。

圖1 各組心室肌細(xì)胞Ik1電流-電壓變化

組別電流密度-140 mV-130 mV-120 mV-110 mV-100 mV-90 mVA組-28.69±2.65-22.58±2.22-18.39±2.24-14.69±1.86-11.64±2.16-7.90±1.45B組-15.2±1.38a-12.4±0.86a-10.42±0.86a-8.48±0.74a-6.83±0.62a-4.92±0.46aC組-20.7±2.37b-16.8±2.13b-14.00±1.75b-11.20±1.59b-8.79±1.27b-6.36±1.04bD組-23.31±2.54-19.06±2.16-15.88±1.81-12.79±1.51-9.99±1.36-7.13±1.02

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較,bP<0.05。

2.3 各組心室肌細(xì)胞APD20、APD50、APD90比較 各組心室肌細(xì)胞APD20、APD50、APD90比較見(jiàn)表2。與A組比較，B組心室肌細(xì)胞APD20、APD50、APD90均升高(P均<0.05)；與B組比較，C組B組心室肌細(xì)胞APD20、APD50、APD90均降低(P均<0.05)

表2 各組心室肌細(xì)胞APD20、APD50、APD90比較

注：與A組比較，aP<0.01；與B組比較,bP<0.01。

3 討論

病理性心肌肥大是導(dǎo)致CHF的主要機(jī)制。惡性室性心律失常導(dǎo)致的SCD是CHF最主要的死因。Ik1在復(fù)極后期和穩(wěn)定心肌細(xì)胞靜息電位發(fā)揮著重要作用。在超級(jí)化狀態(tài)下，內(nèi)向電流顯著增大；弱去極化時(shí)，電流改為外向，使膜電位保持在靜息電位水平。當(dāng)Ik1受到抑制時(shí)，可使膜電位升高，動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)。慢性的血管緊張素Ⅱ刺激心臟能使Ik1電流密度減少，從而延長(zhǎng)APD，導(dǎo)致LQTs[11]。心力衰竭時(shí)心肌細(xì)胞易發(fā)生晚期后除極(DADs)和觸發(fā)活動(dòng)，Ik1的下調(diào)為其主要機(jī)制之一[12]。在小鼠模型中，Kir2.1亞基過(guò)表達(dá)增加Ik1離子通道密度，保證快速和穩(wěn)定的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)，穩(wěn)定細(xì)胞膜電位，抑制折返性心動(dòng)過(guò)速[13]。心力衰竭引發(fā)細(xì)胞水平的電生理重構(gòu)，其中包括蘭尼膽堿受體(RyRs)敏感性增加，促進(jìn)鈣離子釋放和抑制Ik1；增加RyRs的敏感性和減小Ik1促進(jìn)室性早搏和室性心動(dòng)過(guò)速的發(fā)生[14]。有研究顯示，α腎上腺素能受體激動(dòng)劑甲氧胺干預(yù)能抑制兔心肌細(xì)胞的Ik1振幅[15]；PE因?qū)е翴k1減小而促進(jìn)室性心律失常的發(fā)生[16]；PE刺激單個(gè)分離的大鼠心室肌細(xì)胞15 min即導(dǎo)致Ik1的峰值減少45.8%[17]。

CaN參與心肌細(xì)胞肥大和心肌細(xì)胞膜多種離子通道結(jié)構(gòu)和功能改變的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，CaN轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生顯著的心室肥大，并進(jìn)展為心室擴(kuò)張和心力衰竭，給予CaN阻斷劑環(huán)孢素A(CsA)或他克莫司(FK506)干預(yù)明顯抑制該小鼠心室肥大，延緩心力衰竭的發(fā)生和減輕心力衰竭的嚴(yán)重程度[7]。給予血管緊張素II、PE或1%濃度的胎牛血清刺激培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞，導(dǎo)致CaN活性增加、CnAβ基因和蛋白表達(dá)上調(diào)、心肌細(xì)胞肥大；給予CaN抑制蛋白cain/cabin 1和AKAP79干預(yù)能顯著抑制該心肌細(xì)胞肥大和CnAβ基因及蛋白的表達(dá)[18]。在培養(yǎng)的乳鼠心房肌細(xì)胞，機(jī)械牽張刺激促進(jìn)細(xì)胞肥大和CaNA亞基蛋白表達(dá)，抑制編碼瞬時(shí)外向鉀電流離子通道α亞基的Kv4.3蛋白表達(dá)；給予CsA干預(yù)，顯著抑制牽張刺激誘導(dǎo)的心房肌細(xì)胞肥大、CaNA亞基蛋白表達(dá)上調(diào)和Kv4.3蛋白表達(dá)下調(diào)[9]。在培養(yǎng)的乳鼠心室肌細(xì)胞，給予PE刺激促進(jìn)細(xì)胞肥大，上調(diào)細(xì)胞CnAβ蛋白表達(dá)，下調(diào)編碼快鈉電流離子通道α單位的Nav1.5 mRNA和蛋白表達(dá)；給予Ad-CnAβshRNA1沉默CnAβ基因干預(yù)顯著抑制PE刺激的上述效應(yīng)[10]。

CnAβ是CaN調(diào)控心肌肥大主要的功能結(jié)構(gòu)。本研究采用CnAβ基因沉默的方法充分抑制其蛋白表達(dá)，使得CaN喪失發(fā)揮功能活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，評(píng)估CaN活性充分抑制對(duì)Ik1的影響。結(jié)果顯示，與未予PE刺激的null組細(xì)胞比較，在PE刺激的肥大心室肌細(xì)胞Ik1明顯減??；而A1轉(zhuǎn)染沉默CnAβ基因能夠明顯抑制PE誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞Ik1改變。

我們前期的研究結(jié)果顯示，機(jī)械牽張刺激導(dǎo)致乳鼠心房肌細(xì)胞肥大，促進(jìn)CaN A亞基和構(gòu)成Ik1離子通道的Kir2.1蛋白表達(dá)，增大Ik1電流密度；CaN阻斷劑CsA干預(yù)顯著抑制牽張刺激的上述效應(yīng)[8]。并且，我們?cè)谌槭笮氖壹〖?xì)胞離體實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PE干預(yù)促成細(xì)胞肥大及CnAβ蛋白表達(dá)增加，調(diào)控組成鈉離子通道的Nav1.5蛋白表達(dá)[10]。本研究中，PE刺激明顯減小乳鼠心室肌細(xì)胞Ik1電流密度，延長(zhǎng)APD20、APD50和APD90；敲低CnAβ基因顯著抑制PE刺激對(duì)Ik1電流密度和APD的影響。機(jī)械牽張刺激和PE干預(yù)皆導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和CaN A亞基蛋白表達(dá)增加，并且針對(duì)CaN抑制性干預(yù)皆有效，而兩者Ik1電流密度的變化結(jié)果相反，原因不明。針對(duì)離體乳鼠心肌細(xì)胞Ik1的調(diào)控，不排除機(jī)械牽張刺激和PE干預(yù)存在CaN信號(hào)以外的作用機(jī)制影響干預(yù)效應(yīng)，或者是因?yàn)樾姆考『托氖壹〖?xì)胞Ik1離子通道存在差異所致。

綜上所述，CnAβ基因沉默的乳鼠肥大心室肌細(xì)胞Ik1電流密度升高，心室肌細(xì)胞APD20、APD50、APD90均降低。CnAβ可能通過(guò)調(diào)節(jié)Ik1電流密度減小、APD延長(zhǎng)參與心室肥大的發(fā)生發(fā)展。