蘇格木勒-3湯水提物中鎮(zhèn)靜催眠成分的篩選

薩礎(chǔ)拉,朝木日麗格,韓金美,王樹梅

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),呼和浩特 010110)

失眠是一種影響健康的常見疾病。隨現(xiàn)代社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展、生活節(jié)奏不斷加快，失眠日益成為困擾人們身心健康的隱患?xì)⑹?。蒙醫(yī)理論認(rèn)為，引起失眠的原因有外因及內(nèi)因兩種。外因有勞逸失調(diào)、受到驚嚇、思慮過多等；內(nèi)因是體內(nèi)“赫依”增多紊亂，使“三根”失調(diào)，引起心、腦、腎、血管、神經(jīng)相關(guān)疾病，從而導(dǎo)致失眠[1]。蒙藥蘇格木勒-3湯為蒙醫(yī)臨床常用主治失眠的方劑，始載于《四部醫(yī)典》[2]。其味辛，性溫，具有抑赫依作用，主治失眠。由白豆蔻15 g、香旱芹10 g、蓽茇5 g組成。白豆蔻為主藥，味辛、苦，性溫，蒙文名為蘇格木勒，可祛腎寒、鎮(zhèn)赫依、溫中消食，主治腎赫依病、失眠、消化不良等[3]。香旱芹為輔藥，味辛、性平，具有清肺熱、提升胃火、消食的功效[3]。蓽茇為佐藥，有抑赫依、調(diào)理體素、化痰、止痛等功效，味辛，性溫、膩[3]。但蘇格木勒-3湯中治療失眠的主要有效成分目前尚不明確。5-羥色胺(5-HT)、神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)、白細(xì)胞介素1-β(IL-1β)是常用的失眠指標(biāo)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)是臨床常用的氧化損傷指標(biāo)。2018年3月～2018年4月，我們通過建立對(duì)氯苯丙胺酸 (PCPA)大鼠失眠模型，觀察蘇格木勒-3湯水提物對(duì)失眠模型大鼠腦組織5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA的影響，蘇格木勒-3湯水提物中具有鎮(zhèn)靜催眠效果的有效物質(zhì)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 藥品、動(dòng)物及儀器 白豆蔻、香旱芹與蓽茇購(gòu)自內(nèi)蒙古天立藥材公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院圖門巴雅爾教授鑒定為正品。SPF級(jí)SD大鼠102只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，購(gòu)自北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠，合格證號(hào)：11401300076603，許可證：SCXK(京)2014-0004。阿普唑侖片(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H32020215，規(guī)格：0.4 mg/片)；0.9%生理鹽水(山東科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H37022918)；PCPA(美國(guó)Sigma公司，規(guī)格：25 g)；水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度：≥99.5%，批號(hào)：20171211)。Rat5-HT試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司，批號(hào)：20180425)；Rat GABA試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司，批號(hào)：20180425)；IL-1β試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：2301b71122)；SOD測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A001-1)；MDA測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A003-1)。

DL-1型電爐(北京永光明醫(yī)療器械有限公司)；BS323S型電子天平(北京賽多利斯科技儀器有限公司)；FW135型中草藥粉粹機(jī)(天津華新儀器廠)；藥用篩(南京科達(dá)儀器廠)；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，美國(guó)Thermo公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特；DH4000A)；MINI shaker(MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER)；自動(dòng)洗板機(jī)、離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；電動(dòng)勻漿器(FLUKO、F6/10model)。

1.2 蘇格木勒-3湯水提物的制備 分別稱取蘇格木勒-3湯(白豆蔻∶香旱芹∶蓽茇=3∶2∶1)50 g、白豆蔻∶香旱芹(3∶2)42 g、白豆蔻:蓽茇(3∶1)33 g、香旱芹∶蓽茇(2∶1)25 g、白豆蔻25 g、香旱芹17 g、蓽茇8 g加1 000 mL蒸餾水，煎煮30 min后，濾過，濾液蒸干，制作蘇格木勒-3湯水提物、白豆蔻-香旱芹水提物、白豆蔻-蓽茇水提物、香旱芹-蓽茇水提物、白豆蔻水提物、香旱芹水提物、蓽茇水提物，得率分別為18%、17%、20%、32%、11%、37%、29%。按得率計(jì)算最終給藥量。

1.3 大鼠分組與失眠模型制備 取102只大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性組、蘇格木勒-3湯水提物高及低劑量組、白豆蔻-香旱芹水提物高及低劑量組、白豆蔻-蓽茇水提物高及低劑量組、香旱芹-蓽茇水提物高及低劑量組、白豆蔻水提物高及低劑量組、香旱芹水提物高及低劑量組、蓽茇水提物高及低劑量組等17組，每組6只。除空白組外，剩下16組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，每天上午8:00～9:00腹腔射注300 mg/kg的PCPA混懸液(生理鹽水溶解，pH 7～8)，每天1次，連續(xù)注射2 d，制作大鼠失眠模型。2天后，與空白組比較，其他組大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂，白天活動(dòng)不停，毛發(fā)雜亂，興奮性增強(qiáng)，攻擊性增強(qiáng)，大便灰白等顯著的行為學(xué)改變，表明大鼠失眠模型成功[4]。

1.4 蘇格木勒-3湯水提物給藥方法 空白組、模型組大鼠每天生理鹽水灌胃，陽(yáng)性組予阿普唑侖0.09 mg/kg灌胃，蘇格木勒-3湯水提物高及低劑量組分別予108、54 mg/kg的蘇格木勒-3湯水提物灌胃，白豆蔻-香旱芹水提物高及低劑量組分別予84、42 mg/kg的白豆蔻-香旱芹水提物灌胃，白豆蔻-蓽茇水提物高及低劑量組分別予82、41 mg/kg的白豆蔻-蓽茇灌胃，香旱芹-蓽茇水提物高及低劑量組分別予98、49 mg/kg的香旱芹-蓽茇水提物灌胃、白豆蔻水提物高及低劑量組分別予33、16.5 mg/kg的白豆蔻水提物灌胃、香旱芹水提物高及低劑量組分別予74、37 mg/kg的香旱芹水提物灌胃、蓽茇水提物高及低劑量組分別予29、14.5 mg/kg的蓽茇水提物灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d。

1.5 各組大鼠腦組織5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA檢測(cè) 末次灌胃后，將各組大鼠斷頭處死，迅速取出大鼠大腦組織，生理鹽水沖洗后稱重，按組織重量，加入10%生理鹽水組織用電動(dòng)勻漿器勻漿。4 ℃，3 500 rpm離心10 min后取上清液，于-20 ℃或-80 ℃低溫保存。采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠腦組織5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA，測(cè)定各組450 nm處光密度(OD值)，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式，計(jì)算出各組大鼠腦內(nèi)5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA含量。

2 結(jié)果

各組大鼠腦組織5-HT、GABA、IL-1β含量比較見表1。

表1 各組大鼠腦組織5-HT、GABA、IL-1β含量比較

注：與空白組比較,△P<0.05；與模型組比較,*P<0.05。

各組大鼠腦組織SOD、MDA含量比較見表2。

3 討論

目前實(shí)驗(yàn)研究中制作失眠模型的方法有電刺激法[5]、水平臺(tái)法、PCPA法。電刺激法最是通過電流刺激改變大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律。水平臺(tái)法主要阻斷大鼠REM睡眠[6]，剝奪大鼠的深睡眠。前兩種方法由于成本高，耗時(shí)較長(zhǎng)，模型質(zhì)量不穩(wěn)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。有研究[7]報(bào)道，腹腔注射PCPA建立失眠模型的動(dòng)物，在給藥后第3～6天動(dòng)物失眠狀態(tài)最明顯，第7天開始失眠狀態(tài)慢慢恢復(fù)，到第9天失眠狀態(tài)基本消失，但此時(shí)腦內(nèi)5-HT等相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)仍處于低水平。這是因?yàn)镻CPA對(duì)TPH的抑制作用是不可逆的，需要待體內(nèi)PCPA完全消失，并且有新的色氨酸羥化酶分子合成，5-HT才能緩慢恢復(fù)[8]。本實(shí)驗(yàn)中用連續(xù)2天為動(dòng)物腹腔注射PCPA的方法建立失眠模型，于第1次腹腔注射PCPA后36 h，動(dòng)物出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂，興奮性增強(qiáng)，睡眠消失等癥狀。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腦內(nèi)5-HT、GABA含量均減少，與多數(shù)注射PCPA建立睡眠剝奪模型動(dòng)物神經(jīng)遞質(zhì)變化的文獻(xiàn)[9,10]報(bào)道一致，表明造模成功。

表2 蘇格木勒-3湯水提物各組對(duì)大鼠腦內(nèi)SOD、MDA的影響

注：與空白組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

近年來研究[11]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、GABA、IL-1β在睡眠-覺醒節(jié)律過程中等起到重要作用；朱國(guó)慶等[12]發(fā)現(xiàn)選擇性阻斷腦內(nèi)5-HT的合成，可致大鼠失眠；Sherin等[13]發(fā)現(xiàn)增加腦內(nèi)GABA含量，可提高慢波睡眠質(zhì)量；宋媛等[14]發(fā)現(xiàn)增加腦內(nèi)IL-1β的含量，能治療失眠。因而本研究考察了這三個(gè)指標(biāo)，結(jié)果顯示：蘇格木勒-3湯水提物中白豆蔻、香旱芹、蓽茇等水提物均可增加失眠模型大鼠腦內(nèi)5-HT與GABA含量，說明蘇格木勒-3湯水提物中鎮(zhèn)靜催眠作用的有效物質(zhì)基礎(chǔ)來源于各單味藥。據(jù)趙翠仙等[15]等報(bào)道蓽茇乙醇提取物有明顯的抗戊四唑的驚厥作用。蓽茇中的胡椒堿可明顯減少大鼠得自主活動(dòng)，具有一定的鎮(zhèn)靜作用。還可明顯延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘發(fā)小鼠的睡眠時(shí)間。白豆蔻及香旱芹的鎮(zhèn)靜催眠作用還需繼續(xù)深入研究。本研究結(jié)果顯示，雖然蘇格木勒-3湯水提物及各單味藥有降低趨勢(shì)但是作用并不明顯，陽(yáng)性對(duì)照藥物阿普唑侖也沒有起到作用。另一方面，蘇格木勒-3湯水提物中白豆蔻、香旱芹、蓽茇等水提物均可增加失眠模型大鼠腦內(nèi)SOD含量，降低MDA含量，可不同程度顯示出一定的抗氧化能力。這與馮雪等[17，18]研究發(fā)現(xiàn)白豆蔻精油和香旱芹黃酮具有良好的抗氧化效果的報(bào)道一致。

綜上所述，蘇格木勒-3湯水提物中鎮(zhèn)靜催眠作用的有效物質(zhì)來源于白豆蔻、香旱芹、蓽茇等單味藥；白豆蔻、香旱芹、蓽茇可通過降低腦組織MDA、升高SOD含量發(fā)揮震驚催眠作用。