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    化痰通絡(luò)湯預(yù)先灌胃的合并高脂血癥腦缺血大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能、腦組織病理變化觀察

    2018-12-13 11:54:30張振強賈亞泉王自闖郭藝青張金燕李芹宋軍營
    山東醫(yī)藥 2018年43期
    關(guān)鍵詞:高脂血癥通絡(luò)腦缺血

    張振強 ,賈亞泉,王自闖,郭藝青,張金燕,李芹,宋軍營

    (1河南中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心,鄭州450046;2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院)

    高脂血癥是一種全身性脂代謝紊亂性疾病,也是缺血性腦血管病的主要危險因素。高血脂引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血管舒張功能障礙,血管內(nèi)皮功能障礙能夠引起一氧化氮(NO)、血管內(nèi)皮素-1(ET-1)、前列環(huán)素(PGI2)、血漿血栓素(TXB2 )等血管調(diào)節(jié)因子的變化,進而引起動脈粥硬化和缺血性腦損傷[1,2]。缺血性腦損傷后血管新生主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化、細(xì)胞外基質(zhì)降解、管腔形成和毛細(xì)血管生成等[1]。NO、ET-1可共同維持血管張力,反映血管內(nèi)皮功能。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用的血管生成蛋白,CD34 是最敏感的新生血管內(nèi)皮標(biāo)記物[3,4]。有研究[3]表明,在高脂血癥狀態(tài)下血管內(nèi)皮功能受損時血液VEGF 水平下降,且對缺血后腦組織仍有毒性作用。VEGF能夠通過刺激NO的作用顯著地增強血管的舒張,促進受損內(nèi)皮功能的修復(fù)[4]。我們前期實驗研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥合并腦缺血患者血漿中vWFET-1、NO的表達(dá)水平低于單純腦缺血、高血脂患者。化痰通絡(luò)湯由法半夏、橘紅、枳實、黃芪、丹參、山楂、川芎、雞血藤等中藥材配制而成,具有益氣活血,化瘀通絡(luò)之功效,對腦血管疾病具有一定的保護作用。目前關(guān)于化痰通絡(luò)湯對高脂血癥合并腦缺血動物模型中的治療作用相關(guān)報道罕見。2016年12月~2017年2月,我們觀察了化痰通絡(luò)湯預(yù)處理對高脂血癥合并腦缺血模型大鼠的治療作用,并探討其可能作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物、試劑與儀器 SPF級SD大鼠70只,雄性,體質(zhì)量(220±10)g,由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供,質(zhì)量合格證號:37009200004690?;低ńj(luò)湯加減[5](組成:法半夏12 g、橘紅10 g、枳實10 g、黃芪30 g、丹參25 g、山楂20 g、川芎12 g、雞血藤 18 g,以上八味水煎后,濃縮至相當(dāng)于原生藥材1.33 g /mL,備用);檸檬酸(批號:20090306)和檸檬酸鈉(批號:20070403)均購自北京化學(xué)試劑公司。兔抗鼠VEGF和CD34單克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。試劑盒NO、ET-1和VWF試劑盒購于南京建成生物工程有限公司。酶標(biāo)儀(Thermo,型號1510);洗板機(Thermo,型號:888);顯微鏡(OLYMPUS,BX61);切片機(LEICA,2245);電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司,型號FA/JA-B);動物血尿生化分析系統(tǒng)(IDEXX,Procyte DX)。

    1.2 高脂血癥合并腦缺血模型制備與化痰通絡(luò)湯給予方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后,斷尾取血檢測血脂四項值,每天給予高脂飼料(組成:3.5%膽固醇、10%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖、80.8%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng),共喂養(yǎng)6周。分別于高脂飼養(yǎng)前、飼養(yǎng)6周時斷尾取血,檢測大鼠血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白升高,高密度脂蛋白降低(P均<0.05),則說明高脂血癥模型制備成功。將高脂血癥模型大鼠隨機分為高脂血癥對照組(正常組)15只、高脂血癥假手術(shù)組(假手術(shù)組)15只、高脂血癥合并腦缺血組模型組(模型組)20只、治療組20只,按預(yù)實驗死亡率25% 計,保證造模成功后取材的動物數(shù)共70只。飼養(yǎng)第7周開始,治療組予化痰通絡(luò)方1.330 g/(kg·d)灌胃處理,正常組、假手術(shù)組和模型組予等體積生理鹽水,連續(xù)4周,每天1次。飼養(yǎng)第9周時,模型組和治療組根據(jù)Longa[6]報道的線栓法建制備腦缺血模型: 10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠,頸部正中切口鈍性分離皮下組織,暴露暴露左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)。結(jié)扎ECA、CCA,并穿線于ICA,用中號動脈夾夾閉ICA。用眼科剪將CCA剪一小切口,由此迅速插入線栓,輕推線栓使之由頸總動脈通過分叉部進入頸內(nèi)動脈,至大腦中動脈的起點,插入深度約18~22 mm,使其阻斷大腦中動脈的血液供應(yīng)。手術(shù)過程中用白熾燈加熱維持動物體溫。假手術(shù)組手術(shù)過程與模型組相同,分離出左側(cè)的CCA、ECA、ICA,不結(jié)扎血管,不插入線栓。正常組大鼠不做任何處理。

    1.3 各組大鼠 神經(jīng)系統(tǒng)功能及腦梗死體積測算 飼養(yǎng)11周時,5分制評分方法[6]評定模型組、治療組大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能。0分:無體征;1分:動物右側(cè)下肢不能完全伸展;2分:右下肢癱瘓,出現(xiàn)追尾現(xiàn)象;3分:肢體癱瘓,不能站立;4分:動物昏迷,無自主性活動。評級越高,大鼠的行為障礙越嚴(yán)重。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,迅速斷頭取腦組織,去掉小腦,-20 ℃冰箱冷凍20 min。取出腦組織第一刀切在腦前極與視交叉連線中點處,第二刀切在壞死區(qū)呈白色,未壞死區(qū)顏色呈淡紅色視交叉部位,第三刀切在漏斗柄部位,第四刀切在漏斗柄與后葉尾極之間,將腦組織切成5~6片,將切片置于1%四氮唑紅中,錫箔紙蓋住37 ℃避光染色10~30 min,4%多聚甲醛中固定,拍照觀察并測算腦組織壞死區(qū)面積,計算腦梗死體積比。腦梗死體積比=梗死體積/全腦體積×100%。

    1.4 各組腦組織NO、ET-1和vWF檢測 采用ELISA法。飼養(yǎng)11周時,取各組大鼠,腹腔注射麻醉,斷頭取腦,去除嗅腦、腦干、小腦,用預(yù)冷的生理鹽水洗去表面殘血,用濾紙吸干表面殘液,稱重,用事先預(yù)冷的生理鹽水按質(zhì)量與體積比為1∶9的比例,冰浴下制備成10%的腦組織勻漿液,4 000 r/min離心15 min,取上清液,-20 ℃冰箱保存,依照試劑盒說明書步驟,ELISA法檢測腦組織中NO、ET-1和vWF的含量。重復(fù)3次,取平均值。

    1.5 各組大鼠腦組織VEGF、CD34檢測 采用免疫組化法。飼養(yǎng)11周時,取各組大鼠,麻醉后剪開胸腔,充分暴露心臟。首先在右心耳剪一小口,從左心室先灌注生理鹽水,待大鼠前肢和兩肺變白,流出液澄清無血色,改用4%的多聚甲醛灌注固定。斷頭取出全腦,除去小腦,4% 的多聚甲醛固定保存,石蠟包埋切片。常規(guī)脫蠟脫水;用3 % H2O2室溫下7 min滅活內(nèi)源性酶,蒸餾水洗3次;熱修復(fù)抗原,PBS洗2次;滴加5% BSA封閉液,室溫20 min;分別滴加相應(yīng)稀釋的一抗(VEGF和CD34均為1∶400),4 ℃過夜,PBS洗3次;滴加二抗37 ℃孵育20 min,PBS洗3次;滴加SABC,37 ℃孵育20 min,PBS洗4次;DAB顯色,反應(yīng)7 min左右,蒸餾水清洗;蘇木素復(fù)染,1 %的鹽酸酒精分化1 s,脫水,透明,封片。顯微鏡下觀察拍照,采用Image-Pro-Plus 7.0圖像分析系統(tǒng)測其平均光密度值。以平均光密度值代表VEGF、CD34的陽性表達(dá)量。重復(fù)3次,取平均值。

    2 結(jié)果

    2.1 治療組、模型組大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死體積比比較 治療組與模型組大鼠神經(jīng)功能評分分別為(1.63±0.20)、(3.11±0.22)分,二者比較,P<0.05。治療組與模型組大鼠腦梗死體積比分別為16.82%±7.18%、32.97%±9.86%,二者比較,P<0.05。

    2.2 各組大鼠腦組織NO、ET-1、vWF含量比較 各組大鼠腦組織NO、ET-1、vWF含量比較見表1。

    表1 各組大鼠腦組織NO、ET-1、vWF含量比較

    注:與正常組、假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

    2.3 各組大鼠腦組織VEGF、CD34陽性表達(dá)量比較 各組大鼠腦組織VEGF、CD34陽性表達(dá)量比較見表2。

    表2 各組大鼠腦組織VEGF、CD34陽性表達(dá)量比較

    注:與正常組、假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

    3 討論

    中醫(yī)認(rèn)為,高脂血癥合并腦缺血的核心病機為痰瘀阻絡(luò),痰濁和瘀血同時又是臟腑功能失調(diào)、氣血津液代謝失常的病理產(chǎn)物,治以化痰祛瘀通絡(luò),即“痰化癖去,腦絡(luò)暢達(dá),氣血流通,疾病方能向愈”。化痰通絡(luò)方藥由法半夏、橘紅、枳實、黃芪、丹參、山楂、川芎、雞血藤八味藥組成。半夏化痰,雞血藤活血通絡(luò);川芎血中氣藥,丹參味涼血活血,二藥合用具有行氣活血祛瘀之作用;橘紅理氣化痰,枳殼行氣解郁,黃芪健脾益氣,山楂活血消食,食積亦為痰瘀之源,諸藥合用可謂標(biāo)本同治。

    近年來,中藥治療對腦缺血后的血管新生影響的研究也漸成為研究熱點。缺血區(qū)微血管的新生對于腦卒中的治療和神經(jīng)功能恢復(fù)至關(guān)重要,腦缺血后血管新生機制復(fù)雜,由多種促血管生長因子參與。VEGF是主要的調(diào)控因子,能夠作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性多功能因子,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及毛細(xì)血管瓣的生成,從而促進新生血管的生成,VEGF還通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡蛋白表達(dá)維持新生血管中內(nèi)皮細(xì)胞的生存[7~10]。CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物,可作為檢測微血管密度的首選標(biāo)志物[11,12]。新形成的側(cè)枝血管可改善缺血區(qū)周圍的組織灌流及腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)[13]。本研究結(jié)果顯示,模型組腦組織VEGF、CD34表達(dá)增加,化痰通絡(luò)方藥作用后VEGF和CD34的表達(dá)增加更顯著,而且神經(jīng)功能評分降低,缺血面積減少。這表明化痰通絡(luò)方藥能夠預(yù)防性治療高脂血癥合并腦缺血引起的大鼠腦組織損傷,并通過對血管調(diào)節(jié)因子VEGF和CD34表達(dá)的上調(diào)發(fā)揮作用,修復(fù)高脂血癥條件下的缺血組織邊緣區(qū)血管內(nèi)皮功能。也有研究[14~16]表明,VEGF表達(dá)的增加能夠VEGF減少腦梗死面積、減輕腦水腫、促進受損內(nèi)皮功能的修復(fù)的作用,說明血管調(diào)節(jié)因子在高脂血癥條件下的缺血不同時期既有累積現(xiàn)象又有特異性的表達(dá),可能有助于腦缺血恢復(fù)期損傷的修復(fù)[1]。

    本研究結(jié)果還顯示,治療組腦組織NO含量顯著增加,ET-1和vWF含量顯著降低,提示化痰通絡(luò)方藥在修復(fù)高脂血癥條件下的缺血腦組織的血管內(nèi)皮功能障礙方面具有重要作用。vWF是關(guān)鍵的參與缺血性腦中風(fēng)的因素,當(dāng)腦組織發(fā)生缺血時,vWF表達(dá)明顯增加。也有研究[1]發(fā)現(xiàn),ET-1/ NO表達(dá)量下降,可能有利于腦缺血損傷的恢復(fù)。NO 是許多血管生長因子的下游介質(zhì),所以能夠與VEGF相互協(xié)調(diào)共同作用促進血管新生[17],但這個機制還需要進一步的研究證實。

    綜上所述,化痰通絡(luò)湯預(yù)先灌胃的合并高脂血癥腦缺血大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)功能、腦梗死體積均減少,其機制可能為促進腦組織NO、VEGF、CD34表達(dá),降低ET-1和vWF含量。

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