陸地棉微管蛋白基因Ghtub12轉(zhuǎn)棉花研究

沈浙南　沈秋平　彭求

摘要：棉花（Gossypium spp.）是重要的纖維作物，棉花微管蛋白基因在棉纖維發(fā)育過程中特異優(yōu)勢表達(dá)，影響棉纖維品質(zhì)。微管蛋白基因Ghtub12為Tubulin基因家族中的一員，在棉纖維發(fā)育中機理尚不明確。以陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.）R15下胚軸為受體，以0.5 mg/L Basta為篩選標(biāo)記，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Ghtub12遺傳轉(zhuǎn)化棉花。100個胚軸段經(jīng)過抗性愈傷組織誘導(dǎo)，得到143塊愈傷組織，出愈率為71.50%；再經(jīng)過3次抗性篩選獲得126塊愈傷組織，對愈傷組織進(jìn)行PCR檢測，102塊檢測出bar基因，即抗性愈傷組織轉(zhuǎn)化率為81.00%；其中有45塊愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織，分化率為44.12%。胚性愈傷組織進(jìn)行成苗培養(yǎng)得60株苗，對其進(jìn)行PCR檢測，56株擴增出條帶，陽性率為93.3%。獲得了轉(zhuǎn)微管蛋白基因Ghtub12棉花，為進(jìn)一步研究Ghtub12基因在棉花中的可能機理和作用提供了試驗材料。

關(guān)鍵詞：陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.）R15；陸地棉微管蛋白基因Ghtub12；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；下胚軸

中圖分類號：S562 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）18-0106-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.027 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on Micro-tubulin Gene Ghtub12 to Cotton in Gossypium hirsutum

SHEN Zhe-nan，SHEN Qiu-ping，PENG Qiu，LYU Zun-fu，LI Fei-fei

（College of Agriculture，Zhejiang A&F; University，Hangzhou 311300，Zhejiang，China）

Abstract： Cotton is the world's important fiber crop， cotton tubulin gene in cotton fiber development process specific advantages of expression， affecting cotton fiber quality. Tubulin gene Ghtub12 as a member of the tubulin gene family， the mechanism of cotton fiber development is not clear. In this experiment， R15 hypocotyls were used as acceptor， and 0.5 mg/L Basta was used as a screening marker. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method was used to study the genetic transformation. 100 calli were induced by resistance callus， and 143 callus were obtained after 1 month. The recovery rate was 71.50%. After 3 times， the callus was obtained and the callus was obtained. The transformation rate was 81.00%. Among them， 45 callus induced embryogenic callus， the differentiation rate was 44.12%. Embryogenic calli were divided into 60 seedlings. The positive rate was 93.3%. The transgenic tubulin gene Ghtub12 was obtained， which provided experimental material for further study on the possible mechanism and effect of Ghtub12 gene in cotton.

Key words： Gossypium hirsutum Linn. R15； Gossypium tubulin gene Ghtub12； agrobacterium-mediated method； hypocotyls

棉花（Gossypium spp.）是重要經(jīng)濟作物，常以雜交育種來提高棉花產(chǎn)量和增進(jìn)棉花品質(zhì)[1]。但研究發(fā)現(xiàn)棉花產(chǎn)量和品質(zhì)在遺傳上存在一定負(fù)相關(guān)，通過常規(guī)育種很難短期內(nèi)實現(xiàn)棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)同步提升[2]。隨著植物生物技術(shù)的發(fā)展，人們通過外源基因?qū)朊藁ɑ蚪M，能有效提高棉花產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)打破物種間生殖隔離，有目的地將優(yōu)良基因?qū)朊藁╗4]?，F(xiàn)常將轉(zhuǎn)基因育種和常規(guī)育種結(jié)合，在短期內(nèi)可有效提高棉花產(chǎn)量[5]。目前，國內(nèi)外已培育出抗除草劑（轉(zhuǎn)bar基因等）[5]、抗蟲（轉(zhuǎn)bt基因等）[6，7]、抗?。ㄞD(zhuǎn)ptsI基因、hpaXm基因等）[8-10]、抗逆境（轉(zhuǎn)GhGR基因等）[8]和優(yōu)良品質(zhì)改良（轉(zhuǎn)14-3-3L基因等）[11，12]等轉(zhuǎn)基因棉花?？瓜x棉已在國內(nèi)多個地區(qū)廣泛推廣并種植[13]。

目前，棉花轉(zhuǎn)基因常用方法是以棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生為再生方式的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法受棉花基因型限制，僅在部分陸地棉上成功，如珂210、珂312、中棉所系列[14，15]。2007年吳慎杰等[16]將基因Gus導(dǎo)入泗棉3號下胚軸，愈傷組織誘導(dǎo)率73.7%，分化率3.6%。2013年歐婷[17]用農(nóng)桿菌將基因EPSPs-G6導(dǎo)入中棉所49莖段，轉(zhuǎn)化率4.6%；2014年肖向文等[18]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Agip1基因?qū)胄玛懺?3號棉花下胚軸，在Basta濃度為2.5 mg/L的條件下出愈率21.9%，抗性愈傷率19.1%。2016年蔡云巧[19]用農(nóng)桿菌LBA4404將基因ATSUS3導(dǎo)入CRR14棉花下胚軸，出愈率92.5%，分化率21%。2016年肖松華等[20]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Gafp基因?qū)腙懙孛尢K研060下胚軸，出愈率71.4%，分化率4.1%。

棉花是重要纖維作物，纖維品質(zhì)對棉花經(jīng)濟價值具有重大影響。棉纖維發(fā)育過程可劃分為4個階段，即纖維起始、初生壁形成、次生壁形成、纖維脫水成熟[21]。在棉纖維初生壁和次生壁形成期，主要進(jìn)行細(xì)胞伸長與生長，該過程對棉花纖維品質(zhì)產(chǎn)生重要影響，初生壁階段直接影響棉花纖維長度，次生壁階段直接影響纖維強度[22]。Tubulin基因家族與纖維伸長具有相關(guān)性，即在棉纖維伸長期與微管蛋白有著密切的關(guān)系。Chandler等[23]于1978年前提出“multi-tubulin”假說，認(rèn)為不同微管蛋白異型體組成了細(xì)胞內(nèi)不同微管結(jié)構(gòu)。由α微管蛋白和β微管蛋白二聚體組成微管蛋白的基本單位。2002年李園莉等[24]用EST方法得到一個微管蛋白基因Ghtub1，并用Noether雜交技術(shù)，對Ghtub1基因在不同器官和發(fā)育時期進(jìn)行跟蹤觀察。研究發(fā)現(xiàn)Ghtub1基因僅在纖維形成過程中進(jìn)行表達(dá)，即Ghtub1基因?qū)w維發(fā)育特異性發(fā)揮作用。2016年曾志峰[25]利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Ghtub7基因轉(zhuǎn)入翼棉14中，發(fā)現(xiàn)Ghtub7在纖維次生壁形成過程中高效表達(dá)，對棉纖維強度與長度有重要影響。當(dāng)Ghtub7在這一過程中過度表達(dá)時纖維長度減少8.73%～12.20%，當(dāng)人為去抑制Ghtub7表達(dá)時纖維長度會增加13.2%～15.2%。目前為止，已知的Tubulin基因家族在主要種植陸地棉中有38個成員，但在棉纖維發(fā)育過程中的調(diào)控機理還未明確報道過。

Ghtub12基因在棉纖維初生壁形成期進(jìn)行優(yōu)勢表達(dá)，對棉花纖維品質(zhì)具有重要影響。本研究選取陸地棉R15為材料，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將微管相關(guān)基因Ghtub12轉(zhuǎn)化棉花R15下胚軸，經(jīng)抗性愈傷組織誘導(dǎo)和增殖、胚性愈傷組織誘導(dǎo)、胚狀體分化、成苗及PCR檢測等過程，獲得轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步研究Ghtub12基因在纖維形成階段的作用機理和提高纖維品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

陸地棉R15種子，含Ghtub12基因農(nóng)桿菌LBA4404菌液。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗培養(yǎng)及受體制備 取陸地棉R15種子用75%乙醇消毒30 s，30%H2O2浸泡3～4 h，在超凈臺上用無菌水洗滌3～5次，用無菌水浸泡過夜至種子露白。用無菌水洗滌露白種子2～3次，將處理好的種子按每瓶6顆接種C1培養(yǎng)基（1/2MS+8.5 g/L瓊脂）上，在28 ℃下暗培養(yǎng)使其萌發(fā)，待莖有明顯伸長時，進(jìn)行光照處理。7～9 d后，取無菌苗下胚軸在超凈臺上切取剪0.5～1.0 cm作受體備用。

1.2.2 棉花遺傳轉(zhuǎn)化過程 含Ghtub12基因的農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)至OD600 nm為1.0左右，用液體培養(yǎng)基C2（MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT）將菌液稀釋至OD600 nm為0.6～0.8。侵染R15的胚軸段8～10 min，用無菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)接至鋪濾紙的共培養(yǎng)C3培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT+8.5 g/L瓊脂+30 g/L葡萄糖+50 mg/L AS）中，25 ℃，暗培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后的下胚軸用含500 mg/L頭孢霉素?zé)o菌水洗滌1次，用無菌濾紙吸去水，然后按每瓶5段將其轉(zhuǎn)移到選擇C4培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT+2.5 g/L Gelrite+30 g/L葡萄糖+0.75 g/L MgCl2+300 mg/L特美汀+0.5 mg/L Basta）上，25～30 d繼代一次，待抗性愈傷組織長到直徑為3～5 mm時，將其從胚軸段切下來，按照每瓶5～6個愈傷組織來接種C4培養(yǎng)基，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。待愈傷組織增殖至直徑為7～8 mm時，轉(zhuǎn)接在胚性愈傷組織誘導(dǎo)C5培養(yǎng)基（MS+2.5 g/L Gelrite+30 g/L葡萄糖+0.75 g/L MgCl2+1.9 g/L KNO3）上，每25 d繼代一次。直至出現(xiàn)黃綠色或乳白色呈球形顆粒的胚性愈傷組織，及時將胚性愈傷組織單獨挑取繼代在C5培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖。將胚性愈傷組織散鋪在鋪濾紙的分化C6培養(yǎng)基（MS-NH4NO3+3.0 g/L Gelrite+30 g/L葡萄糖+0.75 g/L MgCl2+0.5 g/L天冬酰胺+1.0 g/L谷氨酰胺）上，每15 d繼代1次，約1～2個月可誘導(dǎo)胚狀體形成。胚狀體進(jìn)一步萌發(fā)成苗，將小苗單獨挑取出來繼代在C5培養(yǎng)基上，待長出3～5片真葉時，溫室嫁接成活。

1.2.3 愈傷組織以及轉(zhuǎn)基因小苗的PCR檢測 用CTAB法提取愈傷組織和轉(zhuǎn)基因小苗葉片的DNA，用bar基因的引物（F：ACCATCGTCAACCACTACA TCG；R：GCTGCCAGAAACCCACGTCAT）進(jìn)行PCR擴增，擴增片段大小為420 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化及分化

選取100個胚軸段作為轉(zhuǎn)化受體，60 d后，出現(xiàn)143塊愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為71.5%。用Basta作為篩選標(biāo)記，經(jīng)3次篩選，獲得了126塊愈傷組織。每塊取部分愈傷組織進(jìn)行DNA提取，其余繼續(xù)增殖培養(yǎng)。用bar基因引物進(jìn)行PCR擴增，共有102塊愈傷組織擴增出目的條帶，檢測轉(zhuǎn)化率為81.0%（圖1）。圖1是部分愈傷組織PCR檢測結(jié)果，除了泳道6和8外，均擴增出目的條帶。

將102塊抗性愈傷組織進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)，經(jīng)過3～5次繼代，有45塊愈傷組織在培養(yǎng)基的接觸面出現(xiàn)胚性愈傷組織，分化率為44.12%（圖2）。

2.2 抗Basta轉(zhuǎn)化棉花和植株再生過程

R15種子經(jīng)過5～7 d培養(yǎng)獲得無菌苗（圖3A）；5～7 cm的胚軸段和農(nóng)桿菌菌液侵染后，進(jìn)行共培養(yǎng)，將培養(yǎng)2 d后表現(xiàn)綠色，無褐化下胚軸（圖3B）轉(zhuǎn)入C4抗性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過2～3月培養(yǎng)，胚軸段顏色變深，兩端長出抗性愈傷組織（圖3C）；出愈率為71.50%。待愈傷組織長大直徑為3～5 cm，切下來單獨繼代在C4培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，待長大7～8 cm（圖3D）時，轉(zhuǎn)入C5胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在愈傷組織和培養(yǎng)基接觸面出現(xiàn)淡黃色，小顆粒狀胚性愈傷組織（圖3E）；及時挑取，進(jìn)行增殖培養(yǎng)得到大量黃色胚性愈傷組織（圖3F）；轉(zhuǎn)入鋪有一層濾紙的C6培養(yǎng)基，部分胚性愈傷組織形成胚狀體（圖3G）。胚狀體單獨挑取進(jìn)一步發(fā)育成小苗（圖3H），共獲得了60顆轉(zhuǎn)基因棉花小苗。

2.3 轉(zhuǎn)基因小苗的PCR檢測

將獲得的60株小苗進(jìn)行bar基因PCR檢測。其中56株擴增出目的條帶，陽性率高達(dá)93.3%。說明經(jīng)本試驗選取0.5 mg/L Basta濃度是可行的。

3 小結(jié)與討論

本試驗以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Ghtub12基因?qū)腙懙孛轗15下胚軸，轉(zhuǎn)化后在抗性篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月，從100段下胚軸中誘導(dǎo)出愈傷組織143塊，出愈率71.50%。用抗除草劑基因bar為標(biāo)記基因，0.5 mg/L Basta除草劑為篩選劑，經(jīng)過3個月篩選后，得126塊愈傷組織，對其進(jìn)行PCR檢測，102塊呈現(xiàn)目的條帶，轉(zhuǎn)化率81.00%。將102塊獲得的抗性愈傷組織進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)3～5個月后，得到胚性愈傷組織45塊，分化率44.12%。將胚性愈傷組織進(jìn)行分化成苗培養(yǎng)，得成活苗60株，有56株呈現(xiàn)陽性，陽性率93.3%。

目前，越來越多轉(zhuǎn)化方法被應(yīng)用于棉花轉(zhuǎn)基因過程中，如利用高速粒子沖擊的基因槍轉(zhuǎn)化法[26]，利用棉花自身生殖細(xì)胞分裂分化的花粉管通道法[27]等。本試驗利用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化后代遺傳穩(wěn)定性好、試驗技術(shù)成熟等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于棉花轉(zhuǎn)基因[28]。但農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法也存在幾個缺點，不僅對棉花受體自身基因型要求高（該方法普遍應(yīng)用于再生能力強的基因型），通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生建立組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體系相比其他方法更耗時耗力[29]。特別在組織培養(yǎng)體系中出愈率、轉(zhuǎn)化率、分化率、轉(zhuǎn)基因小苗陽性率將直接影響這一轉(zhuǎn)化體系是否成功[29]。自棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)形成以來，研究發(fā)現(xiàn)在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系中影響棉花轉(zhuǎn)化效率因素有很多[30]。其中農(nóng)桿菌侵染液濃度、選用植物生長調(diào)節(jié)劑種類、植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比[31]、褐化程度對出愈率影響較大。選用的篩選劑及篩選劑濃度、篩選次數(shù)對轉(zhuǎn)化率有較大影響[32]。棉花品種[33]及受體選用部位[34]是影響棉花分化率主要因素[35]。本試驗中用OD600 nm為0.8的農(nóng)桿菌菌液去侵染陸地棉R15下胚軸， KT：2，4-D配比為1，濃度為0.1 mg/L，在28 ℃下共培養(yǎng)，用0.5 mg/L Basta篩選3次后，出愈率達(dá)71.50%，轉(zhuǎn)化率達(dá)81.10%，分化率達(dá)44.12%。在篩選劑選擇方面，嘗試用在棉花下胚軸轉(zhuǎn)化體系中使用并非很廣泛的除草劑Basta，在經(jīng)過0.5 mg/L Basta篩選3次后，轉(zhuǎn)基因小苗陽性率達(dá)93.3%。本試驗中至少獲得了56株陽性植株，說明Basta篩選成功率較高，能有效地將轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織篩選出來。從轉(zhuǎn)化效率看，本轉(zhuǎn)化體系基本達(dá)到預(yù)期效果，為進(jìn)一步研究Ghtub12基因作用打下基礎(chǔ)。

Ghtub12基因作為一個微管蛋白基因，可能參與棉花纖維發(fā)育形成過程。結(jié)構(gòu)蛋白是棉纖維形成過程中的重要蛋白，在纖維細(xì)胞形成期對纖維細(xì)胞橫向與縱向排列有決定作用，進(jìn)而影響棉纖維長度與厚度[36]。Ghtub12基因可能直接編碼成纖維形成過程中的結(jié)構(gòu)蛋白，通過結(jié)構(gòu)蛋白影響纖維排列方向，從而影響纖維結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)一步影響纖維長度與強度。棉纖維形成過程中受到各種植物生長調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)，生長調(diào)節(jié)劑在棉纖維成型過程表達(dá)時間與表達(dá)量，會直接影響纖維形成4個階段時間長短，從而影響棉花品質(zhì)[37]。Ghtub12基因編碼成影響纖維形成相關(guān)激素蛋白，通過生長調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)，影響纖維形成不同階段時間長短，進(jìn)而影響纖維品質(zhì)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳旭升，狄佳春，劉劍光，等.轉(zhuǎn)基因棉花育種進(jìn)展及其產(chǎn)業(yè)化前景分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2002，18（2）：72-74.

[2] 秦永華，喬志新，劉進(jìn)元.轉(zhuǎn)基因技術(shù)在棉花育種上的應(yīng)用[J].棉花學(xué)報，2007，19（6）：482-488.

[3] 李常鳳，鄭曙峰.轉(zhuǎn)基因棉花研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2015，21（3-4）：17-21.

[4] IQBAL M J，REDDY O K，ELZIK K M，et al. A genetic bot- tleneck in the envolution under domestication of upland cotton Gossypium hirsutum L. examined using DNA fingerprinting[J].Theoretical and Appliede Genetics，2001，103（4）：548-550.

[5] 馬小艷，彭 軍，馬 艷，等.不同生育轉(zhuǎn)基因抗草甘膦抗蟲棉花對草甘膦的耐受性[J].植物保護學(xué)報，2013，40（5）：458-461.

[6] 繆衛(wèi)國.轉(zhuǎn)hpa1Xoo基因棉花抗病蟲防衛(wèi)反應(yīng)與全基因組轉(zhuǎn)錄譜分析及棉花角斑病菌hpaXm基因的功能[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[7] 翁 琴.海島棉（G.barbadense L.）莖尖再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗蟲基因（Bt；SATI）轉(zhuǎn)化研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[8] 宋貴方，樊偉麗，王俊娟，等.陸地棉干旱脅迫響應(yīng)基因GhGR的克隆及特征分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（8）：1644-1652.

[9] 王少偉.基因ptsI、hprK和clpX對棉花角斑病菌環(huán)境適應(yīng)性的影響[D].鄭州：河南大學(xué)，2015.

[10] 王慕瑾，劉 悅，孫 超，等.棉花角斑病菌hpaXm基因突變體與互補載體構(gòu)建[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，41（12）：75-81.

[11] 石海燕，王秀蘭，李登弟，等.棉花14-3-3L基因的分子鑒定及其在纖維發(fā)育中優(yōu)勢表達(dá)分析[J].遺傳學(xué)報，2007，34（2）：151-159.

[12] YANG Y W，BIAN S M，YAO Y，et al.Comparative proteomic analysis provides new insights into the fiber elongating process incotton[J].Journal of Proteome Research，2008，7（11）：4623-4637.

[13] 陳萌山.中國棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展有關(guān)問題研究——在中國棉花學(xué)會2014年年會上的報告[J].中國棉花，2014，41（9）：38-43.

[14] 陳志賢，范云六，李淑君，等.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)移tfdA基因獲得可遺傳的抗2，4-D棉株[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994，27（2）：31-37.

[15] 曾小林.亞洲棉GaP5CS和GaTPS基因啟動子的克隆與功能分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

[16] 吳慎杰，李飛飛，陳天子，等.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化泗棉3號的研究[J].作物學(xué)報，2007，33（4）：632-638.

[17] 歐 婷.基于抗草甘膦基因的棉花莖尖農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2013.

[18] 肖向文，劉海峰，李雪源，等.‘新陸早33號棉花轉(zhuǎn)基因體系建立及AtPGIP1基因的導(dǎo)入[J].西北植物學(xué)報，2014，34（4）：658-664.

[19] 蔡云巧.AtSUS3基因的克隆及對棉花的遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].西安：陜西師范大學(xué)，2016.

[20] 肖松華，趙 君，劉劍光，等.轉(zhuǎn)天麻抗真菌蛋白基因提高棉花對黃萎病抗性[J].作物學(xué)報，2016，42（2）：212-221.

[21] 楊 君，馬峙英，王省芬.棉花纖維品質(zhì)改良相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49（22）：4310-4322.

[22] 古力再拜爾·阿地力.棉花纖維品質(zhì)檢驗發(fā)展進(jìn)程探究[J].科技風(fēng)，2015（13）：112.

[23] CHANDLER F，PETER A S，ELAINE Y L.Regulation of flagellar tubulin synthesis in Naegleria[J].Cell Reproduction，1978：337-350.

[24] 李園莉，孫 杰，夏桂先，等.棉花微管蛋白基因GhTub1在纖維細(xì)胞中的特異表達(dá)[J].中國科學(xué)（C輯：生命科學(xué)），2002，32（5）：385-391.

[25] 曾志鋒.GhTUB7在棉纖維發(fā)育中的功能[D].重慶：西南大學(xué)，2016.

[26] 李保山.基因槍法在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用[J].科技信息（科學(xué)教研），2008（17）：648-649.

[27] 郝秀英，孟慶玉，李仁敬，等.用花粉管通道法將外源DNA導(dǎo)入新疆棉花初探[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996（2）：67-68.

[28] 郜旭芳.植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究和應(yīng)用[J].科協(xié)論壇（下半月），2010（4）：70-71.

[29] 李燕娥，焦改麗，吳家和，等.棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系[J].中國棉花，2000，27（5）：10-11.

[30] 吳慎杰.陸地棉農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化與利用[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[31] 董合忠，焦改麗，陳志賢.2，4-D、KT對棉花愈傷組織的誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報，1993，8（3）：87-91.

[32] 李俊蘭，張寒霜，高 鵬，等.卡那霉素對棉花下胚軸愈傷組織生長的影響[J].棉花學(xué)報，1997（4）：42-45.

[33] 魏延宏.農(nóng)桿菌介導(dǎo)海島棉（Gossypium barbadense Linn.）遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究[D].新疆石河子：石河子大學(xué)，2013.

[34] 張朝軍.棉花葉柄高效再生體系的建立與遺傳分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008.

[35] 王 鈺.棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系建立[D].杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2014.

[36] 周 穎.14-3-3蛋白參與BR信號調(diào)控及其在棉花（Gossypium hirsutum）纖維發(fā)育中的功能研究[D].武漢：華中師范大學(xué)，2014.

[37] 韓秀蘭.棉花纖維發(fā)育激素變化、α-微管蛋白基因的差異及親緣關(guān)系分析[D].山東青島：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.