清下活血方對重癥急性胰腺炎大鼠小腸黏膜IL-6mRNA、IL-10mRNA及MUC2表達的影響

呂冠華，趙書奇，包永欣，武春苗，張曉菲

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽 110034；2. 沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016；3. 山西省太原市中心醫(yī)院，山西 太原 030009)

重癥急性胰腺炎(SAP)是臨床常見的重癥急腹癥之一，占急性胰腺炎(AP)的10%～20%，其病死率高達30%，目前對于該病的發(fā)病機制尚未完全闡明，后續(xù)發(fā)展包括急性呼吸衰竭、膿毒癥、多器官功能衰竭等[1]。SAP早期常并發(fā)腸屏障功能障礙，導致腸黏膜通透性增加，腸源性細菌和內(nèi)毒素(ET)移位進入血液和淋巴循環(huán)，會誘發(fā)全身炎癥反應綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)[2]。同時，人體單核巨噬細胞系統(tǒng)激活，大量腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素、白細胞介素(IL)等炎性因子釋放，觸發(fā)級聯(lián)反應，可進一步加重腸道組織損傷。因此，維持腸道正常生理功能，對防止腸源性感染，控制SAP發(fā)展及預防并發(fā)癥具有重要作用。目前，關于中藥治療SAP的報道很多。中醫(yī)認為AP以濕、熱、瘀、毒蘊結(jié)中焦，導致脾胃升降、腸之傳化功能失常為主要病機，在治療上以通里攻下法為主，配合疏肝理氣、清熱解毒、活血化瘀等，使胃腸積滯下達，邪有出路。中醫(yī)治療對縮短SAP病程、減少并發(fā)癥、降低病死率均有十分重要的意義。本實驗通過建立SAP大鼠模型，觀察了清下活血方對小腸黏膜組織中促炎抗炎細胞因子IL-6mRNA、IL-10mRNA及黏蛋白MUC2表達水平的影響，旨在探討該方對SAP腸黏膜的保護作用機制，為臨床治療SAP提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 實驗資料

1.1動物與分組 清潔級SD大鼠72只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄不拘。由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK(遼)2015-0001。適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為假手術組、模型組和中藥組，每組24只。由于SAP大鼠病死率較高，為保證實驗結(jié)果，模型組與中藥組實驗過程中死亡大鼠均由同批大鼠及時補充。

1.2試劑、儀器及藥物 動物組織總RNA提取試劑盒(DP431)購自北京天根生化科技有限公司；One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ購自日本Takara公司；引物序列由沈陽博洋生物技術有限公司合成；MUC2免疫組化試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供；Thermal Cycler Dice Real Time System Single(熒光定量PCR儀)，TP850，日本Takara公司。?；悄懰徕c購自美國Sigma公司；清下活血方(大黃10 g、黃芩10 g、赤芍10 g、厚樸15 g、枳實10 g、桃仁10 g、紅花10 g、莪術10 g、甘草6 g)中各中藥由遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院智能藥房以顆粒劑形式提供，顆粒劑購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，給藥劑量按人與大鼠體表面積換算，將中藥配制成濃度為40.95%溶液。

1.3模型制備 3組大鼠術前12 h禁食不禁水，予10%水合氯醛注射液3 mL/kg腹腔麻醉后，將其固定于手術板上。備皮，碘伏消毒，于腹正中切口入腹，切口長度2～3 cm。充分暴露十二指腸及胰腺，尋找胰膽管，于肝門處用動脈夾將胰膽管夾閉，用1 mL注射器連一次性靜脈輸液針，磨鈍針頭由十二指腸前壁進針，經(jīng)乳頭部插入胰膽管內(nèi)，以0.1 mL/min的速度勻速向胰膽管內(nèi)注入5%牛磺膽酸鈉(1 mL/kg)，注射完畢后拔出針頭，加壓5 min，暫時阻閉胰膽管進入十二指腸的開口，觀察到胰腺出現(xiàn)充血水腫，拔針并松開夾閉胰膽管的小動脈夾，分2層縫合腹腔。術后自由飲水，禁食。假手術組麻醉開腹后將十二指腸提出，用棉簽輕輕翻動胰腺數(shù)次后分層縫合腹腔。

1.4術后干預方法 術后2 h，假手術組和模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，中藥組大鼠給予清下活血方灌胃，灌胃劑量均為1 mL/100 g，每12 h 1次，連續(xù)3次。

1.5標本采集與制備 每組中分別于灌胃24，48，72 h各取8只大鼠，麻醉后剖腹，腹主動脈采血約4 mL，離心后收集血清。剪取2段長約2 cm末端回腸，生理鹽水清洗，一段置于10%中性福爾馬林中固定，另一段液氮冰凍，放置于-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.6觀察指標

1.6.1血清淀粉酶水平 用全自動生化分析儀檢測3組大鼠不同時間點血清淀粉酶水平。

1.6.2小腸組織病理學檢查 取2塊末端回腸，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅染色后光鏡下進行組織學觀察，并根據(jù)Chiu等[3]方法對回腸黏膜損傷情況進行評分。

1.6.3小腸黏膜組織中IL-6mRNA、IL-10mRNA表達水平 采用RT-PCR法檢測。根據(jù)GenBank中報道的IL-6、IL-10和β-actin基因序列，應用DNASTAR軟件設計引物；液氮罐中取出組織樣本約100 mg加入1 mL Trizol，迅速研磨成勻漿液，采用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄至cDNA，用Syber Green 熒光定量PCR檢測試劑盒配伍反應體系，放置于熒光定量PCR儀中，設置PCR熱循環(huán)參數(shù)： 95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s， 40個循環(huán)，結(jié)果采用2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量。

1.6.4小腸黏膜組織中MUC2表達水平 采用二步免疫組化法進行檢測，實驗步驟按照說明書進行。結(jié)果判定：高倍鏡下(40×10)觀察，每張切片隨機選取5個視野。MUC2黏蛋白定位于細胞質(zhì)，凡出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞，按陽性細胞比例和陽性細胞強度進行評分，兩項評分之積為MUC2表達水平。陽性細胞比例評分標準：陽性細胞≤5%計0分，陽性細胞≤30%計1分，30%<陽性細胞≤60%計2分，陽性細胞>60%為計3分；陽性細胞染色強度評分標準：細胞質(zhì)內(nèi)無染色計0分，淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠各時間點血清淀粉酶水平比較 模型組和中藥組各時間點血清淀粉酶水平均明顯高于假手術組(P均<0.05)，而中藥組各時間點血清淀粉酶水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠各時間點血清淀粉酶水平比較

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.23組大鼠各時間點小腸組織病理學改變 光鏡下觀察，假手術組大鼠各時間點回腸黏膜組織絨毛結(jié)構(gòu)正常，未見充血及水腫；模型組大鼠回腸黏膜可見不同程度的血管擴張、充血、水腫和炎細胞浸潤；中藥組大鼠回腸黏膜血管擴張、充血明顯減輕，炎細胞浸潤較少，未見明顯水腫。

2.33組大鼠各時間點小腸黏膜損傷指數(shù)評分比較 中藥組各時間點小腸黏膜損傷指數(shù)評分均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表2。

2.43組大鼠各時間點小腸黏膜組織中IL-6mRNA、IL-10mRNA表達水平比較 模型組和中藥組各時間點小腸黏膜組織中IL-6mRNA、IL-10mRNA表達水平均明顯高于假手術組(P均<0.05)；中藥組各時間點IL-6mRNA表達水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，而IL-10mRNA表達水平均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表3。

表2 各組大鼠不同時間點小腸黏膜損傷指數(shù)評分比較分)

注：①與模型組比較，P<0.05。

2.53組大鼠各時間點小腸黏膜組織中MUC2表達水平比較 模型組各時間點小腸黏膜組織中MUC2表達水平均明顯低于假手術組(P均<0.05)，而中藥組各時間點MUC2表達水平均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表4。

表3 3組大鼠各時間點小腸黏膜組織中、IL-10mRNA表達水平比較

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表4 3組大鼠各時間點小腸黏膜組織中MUC2表達水平比較

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

SAP發(fā)展過程中，由于腸道微循環(huán)障礙-缺血再灌注損傷、炎性細胞因子的過度釋放、腸上皮細胞凋亡等多方面不利因素，腸道黏膜屏障功能受損，腸黏膜通透性增加，致使細菌和內(nèi)毒素穿越腸黏膜進入血液循環(huán)，激活單核巨噬細胞系統(tǒng)，促其表達釋放更多的細胞因子和炎性介質(zhì)，進一步加重腸黏膜的損傷，形成惡性循環(huán)[4-5]。另外，當腸黏膜通透性增高到一定程度時，一些大分子物質(zhì)如細菌、脂多糖即穿越受損的腸黏膜向多臟器移位，引起胰腺組織繼發(fā)感染，進而成為SAP患者死亡的主要原因。有研究指出，腸屏障功能障礙和腸內(nèi)細菌易位是引起胰腺組織壞死及胰周感染的重要原因[6]。而細胞因子的過度釋放是造成腸道屏障功能損傷、腸道通透性增加及腸源性感染的重要原因。細胞因子在免疫細胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等方面均起到重要作用，此外還參與機體的多種生理、病理反應。根據(jù)細胞因子在炎癥中的作用，可分為促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子，促炎性細胞因子主要包括IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等，抗炎性細胞因子主要包括IL-4、IL-10、IL-11、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等。IL-6是一種多功能細胞因子，幾乎所有的間質(zhì)細胞和免疫細胞都能分泌IL-6，其中T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、上皮細胞等為主要來源[7]。IL-6與許多疾病密切相關，其可作為早期預測AP嚴重程度的指標，其敏感度和特異度分別為56.0%，90.6%[8]。IL-10是一類被研究最廣泛的抗炎因子，最初被認為是Th2細胞受刺激后分泌的一種細胞因子合成抑制因子[9]。進一步研究顯示，IL-10不僅由Th2細胞分泌，還可由CD4+T、CD8+T細胞、B細胞[10]，Th1細胞[11]，Treg、Th9、Th17[12]、Th22細胞[13]等適應性免疫細胞和樹突狀細胞、NK細胞、肥大細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等固有免疫細胞產(chǎn)生[14]。IL-10能抑制單核-巨噬細胞，并調(diào)節(jié)淋巴細胞和中性粒細胞反應以及細胞因子的產(chǎn)生，參與炎性反應[15]、惡性腫瘤[16-17]、自身免疫性疾病[18-19]的發(fā)生發(fā)展。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠腸黏膜組織中IL-6、IL-10mRNA表達失衡，機體處于促炎細胞因子占優(yōu)勢的狀態(tài)。

黏蛋白是由上皮細胞分泌的高分子量糖蛋白，是黏液的主要組成部分，主要分布于呼吸、消化、泌尿生殖道表面細胞及其分泌的黏液中[20]，對正常黏膜起潤滑和保護作用，能促進炎癥的消退，起到修復和愈合黏膜的作用[21-22]。MUC2廣泛表達在腸道內(nèi)，其單體是含N-端氧化糖基化域和C-端半胱氨酸富含域的同源寡聚體，構(gòu)成了腸黏液層的骨架。膠體形式黏液基因蛋白的主要基因編碼位于11.P15.5染色體上，長度100～500 nm，黏附于腸黏膜表面，通過跨膜區(qū)與細胞膜緊密連接，參與腸上皮細胞膜糖衣的形成[23]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠腸黏膜組織中MUC2表達水平顯著低于假手術組，提示SAP時由于腸上皮細胞破壞，使MUC2分泌不足，腸黏膜層因來源不足而屏障功能減弱。

對于AP的中醫(yī)治療，根據(jù)急則治其標的原則，總以通里攻下法為主，配合清熱解毒、活血化瘀等辨證治療。通里攻下法能使胃腸積滯下達，使邪有出路，六腑暢通，這與西醫(yī)病理學中因SAP導致的腸道微循環(huán)障礙、腸道細菌移位及腸蠕動減緩等認識相似。微循環(huán)障礙和缺血-再灌注損傷是SAP發(fā)生發(fā)展的因素之一，改善胰腺及腸道微循環(huán)對縮短SAP病程、減少并發(fā)癥具有重要意義。清下活血方中大黃、黃芩、厚樸、枳實能抗菌消炎，清理腸道內(nèi)毒素，使邪有出路，避免腸道細菌移位；赤芍、桃仁、紅花、莪術具有活血化瘀、改善胰腺及腸道局部血液循環(huán)的作用。

本實驗結(jié)果顯示，中藥組各時間點血清淀粉酶水平、小腸黏膜損傷指數(shù)評分和小腸黏膜組織中IL-6mRNA水平均明顯低于模型組，而IL-10mRNA和MUC2表達水平均明顯高于模型組。提示清下活血方可通過下調(diào)腸黏膜促炎性細胞因子IL-6的釋放，清除腸黏膜損傷后產(chǎn)生的炎性因子，并一定程度提高腸黏膜抗炎細胞因子IL-10水平，重建促炎和抗炎細胞因子之間的平衡，進而減輕腸道組織損傷，防止SAP的進一步發(fā)展；還可通過增加MUC2分泌量，修復腸黏膜層，保護腸黏膜機械屏障完整性，維持腸道正常生理狀態(tài)。