16個枸杞品種(系)S-RNase基因型鑒定及序列分析

戴國禮，張兆萍，程 慧，4，張 波，焦恩寧，李彥龍，秦 墾*

(1.寧夏農林科學院枸杞工程技術研究所，寧夏銀川 750001;2.國家枸杞工程技術研究中心，寧夏銀川 750001;3.甘肅省農業(yè)工程技術研究院，甘肅武威 733006;4.西南林業(yè)大學林學院，云南昆明 650224)

【研究意義】自交不親和性是植物預防近親繁殖和保持遺傳變異的一種重要機制，在被子植物中普遍存在［1］。根據(jù)植物自交不親和的遺傳控制機理，將植物的自交不親和性分為孢子體型SSI(Sporophytic self-compatibility，簡稱 SSI)、和配子體型GSI(Gametophytic self-incompatibility，簡稱 GSI)［2］。其中，以茄科、薔薇科和玄參科為代表的配子體自交不親和性是最常見的類型［3］?！厩叭搜芯窟M展】多年研究發(fā)現(xiàn)，GSI植物的自交不親和性由單一的多態(tài)性S-位點控制，該位點為多基因復合體，至少包括2個自交不親和反應特異性決定因子:花柱S基因與花粉S基因［4］。研究證實，薔薇科、茄科及玄參科等GSI類植物具有共同的花柱S基因產物，為一種糖蛋白，且發(fā)現(xiàn)其具有核糖核酸酶活性，故稱為S 核酸酶(S-RNase)［5－6］。S-RNase 是雌蕊-花粉相互識別的關鍵物質，可分解花粉管RNA，抑制花粉管的伸長，從而導致自交不親和［7］。繼1981年首次從花煙草花柱提取物中分離出與自交不親和相關的S 糖蛋白，1986 年克隆了 S-cDNA 之后［5－6］，已有大量的S-RNase序列得到了克隆。已明確花柱的SRNase在雌蕊識別和拒絕花粉的過程中起著重要作用［8－9］?！颈狙芯壳腥朦c】寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)在中國分布廣泛，為茄科(Solanacease)枸杞屬(Lycium L.)落葉灌木，屬配子體自交不親和植物。有學者在田間對寧夏枸杞進行了大量的授粉雜交試驗，結果表明，在寧夏枸杞種內存在自交不親和現(xiàn)象，其繁育系統(tǒng)除麻葉系外都屬于專性異交，大多品種具有自交不親和性，在生產上需配置授粉樹［10－11］。育種家已培育出了一定數(shù)量的栽培品種與新優(yōu)系，但目前對各枸杞品種(系)的自交不親和性及相關基因還缺乏系統(tǒng)深入的研究，使得雜交親本選配與配置授粉樹時具有很大的盲目性，且費時費工?！緮M解決的關鍵問題】本研究以16個國內枸杞主栽品種(系)和地方品種為試材，應用PCR、回收、克隆、測序技術，開展枸杞品種(系)S-RNase基因的分子生物學研究，鑒定參試材料的S-RNase基因型，同時了解寧夏枸杞品種自交不親和S-RNase基因的多態(tài)性。同時，通過田間套袋試驗方法，測定親和指數(shù)進行驗證。最終確定各品種的自交親和性及其所含有的S-RNase基因類型，以期為枸杞栽培合理配置授粉樹和雜交親本選配提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的16份枸杞品種(系)種植于寧夏農林科學院國家枸杞工程技術研究中心枸杞種質資源圃(38°38'49″N，106°09'10″E)，于 2016 年春季采集各品種(系)的嫩葉置于－80℃保存(表1)。

1.2 方法

1.2.1 人工授粉與套袋試驗 按照秦 墾等對枸杞屬植物自交親和性的檢測和界定方法［10］，對參試材料花蕾進行以下2種處理:①同株同花人工授粉后套袋，檢測單花自交是否親和;②同株異花人工授粉后套袋，檢測株內自交是否親和［12］。同一品種(系)每個處理選30個花蕾進行試驗，每個實驗進行3次重復，35 d后收獲果實，統(tǒng)計每個果實種子含量，進而計算自交親和指數(shù)。以自交親和指數(shù)高低判斷自交親和性強弱，親和類型的劃分主要參照方智遠、劉后利等的方法進行，自交親和指數(shù)小于5的為自交不親和，自交親和指數(shù)大于5的為自交親和。計算見公式(1)。

自交親和指數(shù)=自交結實種子總數(shù)/套袋自交花蕾數(shù) (1)

1.2.2 DNA提取及S-RNase基因PCR擴增 采用CTAB法提取各品種(系)基因組DNA。根據(jù)茄科S基因一級結構保守區(qū)序列合成PCR擴增兼并引物。由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列信息為:正向 si200:5’-TCYGTWATGMTKAATAACTGC-3’;反向 si552:5’-AAYRCACTTKAGRCTWGGAAC C-3’(圖1)。

摸索擴增條件，建立特異性PCR擴增體系。PCR體系為:依次加入200 ng模板DNA，5 μl 10×Taq Buffer，2.5 nmol dNTPs，正反向引物分別 0.008 nmol，1 U TaqDNA 聚合酶，補充滅菌水至 25 μl，輕彈混勻后加入礦物油，短暫離心。擴增程序:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)，再72℃延伸10 min;4℃保存。

表1 材料名稱及來源Table 1 A list of material name and source

圖1 茄科S基因一級結構Fig.1 The basic structure of Solanaceae S-gene

1.2.3 S-RNase基因擴增產物回收、克隆及測序PCR產物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶的有無。按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，將回收產物連接到PMD18-T載體上，轉化至DH5α感受態(tài)細胞，每個材料挑15～20個陽性單克隆送去測序，確保每個S基因型至少重復測定2次。序列委托上海英濰捷基公司測定。

1.2.4 序列分析與比對 借助EditSeq軟件對測序結果進行預處理，在NCBI中利用Blastn檢索Gen-Bank中已登陸的S-RNase基因同源序列。用DNAMAN進行多序列比對分析，并推導對應的氨基酸，確定測序結果的S等位基因名稱。

2 結果與分析

2.1 S-RNase基因特異性擴增

用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測各供試材料的PCR產物。由圖2可知，各供試材料均在約500 bp處有一條明顯的亮帶。

2.2 枸杞品種(系)S-RNase基因型鑒定

圖2 枸杞品種的S基因特異性擴增Fig.2 The specific amplification of S-RNase fragments from Lycium barbarum L.cultivars

分析測序結果，最終獲得除去兩端載體及引物后長為420 bp的目的片段，分別在NCBI中進行Blast，結合同源比對與序列分析結果，確定均為枸杞屬的S基因(圖3)。DNA多序列比對結果顯示:這17個未知S-RNase基因型的參試材料共涉及9種SRNase基因片段，分別標記為 A、B、C、D、E、F、G、H和I。同時發(fā)現(xiàn)，這9種S-RNase基因片段在2個高變區(qū)內均具有很高的序列多態(tài)性。除‘寧農杞1號’外，其余供試材料均含有其中的2種。依據(jù)植物內含子(5GT-3AG)的序列特點，同時參考已登陸的茄科S-RNase基因一級結構特點，確認了位于高變區(qū)HVa內一段長為109 bp的內含子序列，進而推導出高變區(qū)及其周圍核苷酸對應的氨基酸序列(圖4)。

將這9條序列分別進行Blastn發(fā)現(xiàn)，除G和I兩種序列外，其余7種核苷酸序列與GenBank中已登錄的枸杞S-RNase等位基因部分編碼區(qū)序列相似性均在99%以上，分別為:A序列與S-BARB2(GI:323320147)、B序列與S-BARB8(GI:323320159);C序列與S-BARB3(GI:323320149);D序列與SBARB6(GI:323320155);E序列與S-CHIN3(GI:323320165);F序列與S-BARB9(GI:323320161);H序列與S-CHIN6(GI:323320169)。由以上7種類型的S-RNase基因核苷酸序列推導的氨基酸和對應同源性最高的已登錄S-RNase等位基因推導的氨基酸序列也完全一致，依據(jù)S-RNase基因相同時其DNA序列同源性應為100%的原理，認定為同一種基因。

2.3 2個新S-RNase基因型的序列分析

同源性分析結果顯示，G序列與已登錄S等位基因 S-BARB6(GI:323320155)一致性最高，達98%，推導的氨基酸序列一致性達95%。分析其氨基酸序列特征，在高變區(qū)HVa有2個氨基酸發(fā)生變化:由T→A的突變，導致 M(Methionine)→K(Lysine)的變化;由C→G的突變，導致P(Proline)→A(Alanine)的變化。在高變區(qū)HVb有1個氨基酸發(fā)生變化:由G→C的突變，導致K(Lysine)→N(Asparagine)的變化。在保守區(qū)C3、C4之間有2個氨基酸發(fā)生變化。分析比較已登錄的枸杞屬S等位基因，發(fā)現(xiàn)S基因的多態(tài)性主要是因為高變區(qū)(H V)的變異，通常根據(jù)高變區(qū)的不同來確認不同的S等位基因，由此認定G序列為一個新的S-RNase等位基因，暫將其命名為S-BARB6n。

圖3 S-RNase基因序列同源性比較Fig.3 Alignment of nucleotide sequences of S-RNase

圖4 9種片段推導的氨基酸序列Fig.4 Putative amino acid sequences of nine fragments

圖5 G序列與S-BARB6等位基因DNA序列比對Fig.5 The result of DNA sequences alignment between G and S-BARB6 allele

圖6 G序列與S-BARB6等位基因的氨基酸序列比對Fig.6 The result of amino acid sequences alignment between G and S-BARB6 allele

圖7 I序列與S-PUMI5u等位基因DNA序列比對Fig.7 The result of DNA sequences alignment between I and S-PUMI5u allele

圖8 I序列與S-PUMI5u等位基因的氨基酸序列比對Fig.8 The result of amino acid sequences alignment between I and S-PUMI5u allele

I序列與已登錄S等位基因S-PUMI5u(GI:323320217)一致性最高，達96%，推導的氨基酸序列一致性達89%，分析比較氨基酸序列特征，在高變區(qū)HVa有6個氨基酸發(fā)生變化:由G→T的突變，導致D(Aspartic acid)→Y(Tyrosine)的變化;由G→C的突變，導致R(Arginine)→P(Proline)的變化;由C→G的突變，導致F(Phenylalanine)→L(Leucine)的變化;由G→A的突變，導致D(Aspartic acid)→N(Asparagine)的變化;由C→A的突變，導致T(Threonine)→K(Lysine)的變化;由C→G的突變，導致L(Leucine)→V(Valine)的變化。在高變區(qū)HVb有3個氨基酸發(fā)生變化:由GAG→CGA的突變，導致K(Lysine)→N(Asparagine)的變化;由C→A的突變，導致S(Serine)→D(Aspartic acid);由C→A的突變，導致A(Alanine)→D(Aspartic acid)。在保守區(qū)C3、C4之間有2個氨基酸發(fā)生變化。認定I序列也是一個新的S-RNase等位基因，暫命名為S-PUMI5un。

2.4 參試材料自交(不)親和性的田間驗證

通過田間授粉實驗，可以發(fā)現(xiàn)參試的16個品種(系)，有11個屬于自交不親和材料，和同株自花交和同株異花交自交親和指數(shù)小于5的為自交不親和;5個屬于自交親和材料，其同株自花交自交和同株異花交自交親和指數(shù)大于5的為自交親。

其中自交親和品種(系)的基因型為:‘寧杞1號’、‘寧 農杞 3 號’、‘03-08’、(S-BARB2/SBARB8)，‘寧杞7號’(S-BARB8/S-BARB6)、‘山東黃果枸杞’(S-BARB2/S-PUMI5un);其中自交不親和品種(系)的基因型為:‘中國枸杞’(S-BARB2/SCHIN6)，‘云南枸杞’(S-BARB3/S-CHIN3)，‘黃果枸杞’(S-BARB3/S-BARB6n)，‘寧杞 5號’(SBARB2/S-CHIN3)，‘寧農杞 1號’(S-BARB2/SBARB2)，‘寧農杞 2號’(S-BARB2/S-BARB6n)，‘寧農杞9號’(S-BARB2/S-BARB9)，‘07-05’(SBARB8/S-BARB6n)，‘06-16’(S-BARB2/S-CHIN3)，‘07-08’(S-BARB8/S-BARB6n)，‘13-01’(S-BARB 2/S-CHIN3)。

3 討論

3.1 枸杞SI與SC之間S-RNase基因型比較

本研究對11個自交不親和5個自交親和品種(系)的 S-RNase基因型進行比較分析發(fā)現(xiàn):SBARB2、S-BARB8等位基因具有很高的基因頻率，氨基酸多序列比對結果顯示，S-BARB8等位基因在C4保守區(qū)后的外顯子位置與其他幾種等位基因相比有2個位點的氨基酸同時發(fā)生變化，即Q/D→L和D/G→H，由此引起的S-RNase基因表達產物的變化，有可能是枸杞自交不親和向自交親和突變發(fā)生的根本原因。枸杞自交不親和S-RNase基因的系統(tǒng)進化演變，還需進一步研究。

3.2 枸杞S-RNase的氨基酸序列的特異性

枸杞屬(Lycium L.)從經(jīng)典分類學上屬于為茄科(solanacease)，茄科中S-RNase有5個保守區(qū)域(C1 到 C5)和 2 個高變異區(qū)(Hva 和 HVb)［16－17］。并且在茄科的S-RNase中存在的潛在N-糖基化保守位點在C2區(qū)，對比其他配子體自交不親和植物，如薔薇科的S-RNase的C2區(qū)卻沒有包含N-糖基化位點，同時Ushijima［18］等的研究中，提出薔薇科的 SRNase不僅有 C1、C2、C3、C4，4 個保守區(qū)，而且還有一個RC4區(qū)，RC4是薔薇科所特有的專一性區(qū)域，在其他T2/S型的S-RNase中沒有發(fā)現(xiàn)。并且指出高度變異區(qū)RHV定位在與茄科S-RNase的高變異區(qū)相似的位置，茄科S-RNase的另一個變異區(qū)HVb在薔薇科的S-RNase中卻是保守的［14］。本研究所克隆的枸杞S-RNase基因片段，大小為420 bp，包含了C2、C3、C4保守區(qū)，和 2個高變異區(qū)(Hva和HVb)，并對不同品種(系)的S-RNase基因型進行了鑒定，但是沒有得到全長序列，對其結構和特異識別位點的分析存在難度，這也是本研究的不足之處。

表2 16個枸杞品種(系)的自交親和性及其S-RNase基因型Table 2 The self-compatibility and S-RNase genotypes of seventeen Lycium L.cultivars

3.3 枸杞S-RNase基因型鑒定的意義

已證實，品種間的親和性和S-RNase基因型間存在密切聯(lián)系，若2個品種的S-RNase基因型相同，則相互授粉不親和，否則表現(xiàn)為親和。對于鑒定出的11份自交不親和枸杞品種(系)，生產中在配置授粉品種或雜交育種在選配親本時，品種間的親和性是首要考慮因素，而本研究S-RNase基因型鑒定結果即可提供有利依據(jù)。

本研究結果不僅豐富了枸杞屬植物的自交不親和基因信息，同時能為生產中授粉樹的配置，雜交育種親本選配提供理論依據(jù)。繼續(xù)深入研究枸杞花柱、花粉S-RNase基因及表達產物功能與相互作用機制是未來枸杞自交不親和性研究領域重要的發(fā)展方向。

4 結論

本研究以16個品種(系)為材料，共克隆9個S等位基因，分別為 S-BARB2、S-BARB3、S-BARB6、SBARB8、S-BARB9、S-CHIN3、S-CHIN6，并發(fā)現(xiàn) 2 個新的S等位基因，暫分別命名為 S-BARB6n，S-PUMI5un。所克隆獲得的9個枸杞S-RNase基因均包含了C2、C3、C4保守區(qū)，和2個高變異區(qū)(Hva和HVb)。通過田間驗證試驗證明，11個品種(系)為自交不親和材料，5個為自交親和材料。枸杞屬植物存在S-RNase等位基因，其基因序列與茄科植物具有一定相似性，枸杞S-RNase基因是控制枸杞自交不親和性的關鍵基因，可根據(jù)本實驗結果進行授粉樹的配置和雜交育種親本選配。