無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及缺血下肢的影響

高廣生　潘蕊　苗曉東　李虹　聶亞東　劉淑華　李姝婷　朱東放　李懿宏

[摘要] 目的 觀察無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)糖尿病下肢缺血大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及對(duì)缺血下肢的影響。方法 將成功建模的糖尿病下肢缺血大鼠隨機(jī)分為2組（每組27例）：心肌缺血/再灌注組（A組）及預(yù)適應(yīng)組（B組）。A組大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎30 min后開通2 h；B組大鼠缺血下肢行結(jié)扎5 min后開通5 min，共3次，連續(xù)3 d，第4天同A組實(shí)驗(yàn)。觀察比較兩組大鼠心電圖ST段變化程度、肌酸激酶同工酶（CK-MB）值、缺血心肌質(zhì)量與左心室質(zhì)量的比值（AAR/LV）、梗死心肌質(zhì)量與左心室質(zhì)量的比值（IA/LV）、梗死心肌質(zhì)量與缺血心肌質(zhì)量的比值（IA/AAR）以及缺血下肢與健肢的血流值比率（R/L）。 結(jié)果 與A組相比，B組ST段抬高幅度、CK-MB值、IA/LV、IA/AAR值明顯降低，R/L有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）。 結(jié)論 無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)能明顯降低大鼠心肌缺血/再灌注時(shí)的ST段抬高幅度、CK-MB值及心肌梗死面積，且對(duì)已發(fā)生缺血的下肢無(wú)顯著影響。

[關(guān)鍵詞] 缺血預(yù)適應(yīng)；糖尿病；心肌梗死；缺血下肢

[中圖分類號(hào)] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-4062（2018）07（a）-0054-03

無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)是指預(yù)先對(duì)一肢體進(jìn)行缺血處理，對(duì)隨后發(fā)生的遠(yuǎn)隔器官的缺血損傷有保護(hù)作用。很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究都證實(shí)了缺血預(yù)適應(yīng)的心臟保護(hù)作用[1]，但關(guān)于缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)合并糖尿病的患者或動(dòng)物的心臟保護(hù)作用的研究相對(duì)較少，且結(jié)果不一[2-4]。同時(shí)，因臨床上很多糖尿病患者伴有肢體外周血管病變，而缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)病變肢體血管的影響尚無(wú)臨床及動(dòng)物研究。該研究擬建立糖尿病并下肢慢性缺血的大鼠模型[5]，觀察無(wú)創(chuàng)性缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及對(duì)缺血下肢的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 6～7周齡健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，由哈爾濱市呼蘭區(qū)楊林鄉(xiāng)鼎盛養(yǎng)殖場(chǎng)提供并飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑 檸檬酸鈉緩沖液、戊巴比妥鈉、水合氯醛、CK-MB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），鏈硫脲菌素、Evans blue染色劑（美國(guó)sigma），TTC染色劑（上?；瘜W(xué)試劑公司）。

1.1.3 設(shè)備 血糖儀（羅氏）、激光多普勒血流成像儀（瑞典）、多功能電生理儀（華南醫(yī)用電氣）、超低溫高速離心機(jī)（Backman Coulter）、電熱恒溫振蕩水浴箱（上海）、冰箱（新飛）、電子分析天平（Mettler Toledo）。

1.2 模型建立與分組實(shí)驗(yàn)

1.2.1 糖尿病模型的建立 高脂飼料（熱量比為蛋白質(zhì)：脂肪：碳水化合物=1∶3∶1）飼養(yǎng)60名大鼠，6個(gè)月后，做標(biāo)記并稱質(zhì)量，禁食12 h，不禁水，檸檬酸鈉緩沖液稀釋鏈脲佐菌素，按35 mg/kg的劑量腹腔注射，48 h后用血糖儀測(cè)尾靜脈血糖，以隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L為造模成功，7 d后復(fù)測(cè)隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L的大鼠入選實(shí)驗(yàn)，共58只大鼠入選。

1.2.2 下肢缺血模型的建立 58只大鼠均取右下肢造模，左下肢作為對(duì)照。2%戊巴比妥鈉以50 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉后，取仰臥位，四肢牽拉固定于手術(shù)臺(tái)，右下肢備皮消毒，于右側(cè)腹股溝處縱行切開右下肢正中的皮膚，暴露血管神經(jīng)束，分離出股動(dòng)脈并結(jié)扎，激光多普勒血流儀記錄雙下肢血流灌注值，以右下肢比左下肢血流減少約70%確認(rèn)建模成功，28 d后復(fù)測(cè)右下肢/左下肢血流比率<75%的大鼠入選實(shí)驗(yàn)，共54只大鼠入選。

1.2.3 進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)及心肌缺血/再灌注 將成功建模的54只大鼠隨機(jī)分為2組：缺血/再灌注組（A組）及預(yù)適應(yīng)組（B組），各27只。A組大鼠以10%水合氯醛以0.3g/kg的劑量腹腔注射麻醉后，連接肢導(dǎo)心電，氣管切開，呼吸機(jī)輔助呼吸，在左鎖骨中線3、4肋間處行縱形切口，以小型開胸器暴露胸腔。切開心包，在冠狀動(dòng)脈左前降支中、上1/3交界處以絲線結(jié)扎30 min后，松開絲線使冠狀動(dòng)脈開通至2 h。B組大鼠用2%戊巴比妥鈉溶液以30 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉后，以橡皮筋捆綁大鼠右下肢根部至超聲示下肢動(dòng)脈血流消失，持續(xù)5 min，再松開5 min，如此捆綁/松開共3次，連續(xù)3 d，第4天操作同A組。

1.3 觀察指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 心電圖 分別在心梗前、心梗后30 min、再灌注后30 min、再灌注后2 h測(cè)心電圖ST段抬高幅度。

1.3.2 心肌酶 于再灌注后2 h于右心室取血2 mL，凝固并離心后取血清測(cè)CK-MB 值。

1.3.3 心肌梗死面積 右心室取血后結(jié)扎左前降支，將Evans blue染色劑從主動(dòng)脈逆行注入心臟，剪下心臟后用生理鹽水沖洗干凈，放入冰箱中冷凍20 min。垂直心臟長(zhǎng)軸方向切片（厚約1 mm）。電子天平稱量左心室質(zhì)量（LV），再剔取缺血部分（未染色部分）稱質(zhì)量（ARR），并計(jì)算缺血部分質(zhì)量占左心室質(zhì)量的百分比（AAR/LV）。將缺血部分切片放入TTC中，37℃水浴30 min，梗死部分呈蒼白色，剔取梗死部分的心肌稱質(zhì)量（IA），并計(jì)算梗死部分質(zhì)量占左心室質(zhì)量的百分比（IA/LV），最后計(jì)算梗死部分質(zhì)量與缺血部分質(zhì)量的百分比（IA/AAR）。

1.3.4 下肢血流值 用激光多普勒血流儀分別記錄預(yù)適應(yīng)組大鼠在預(yù)適應(yīng)前、心梗后30 min及再灌注后2 h雙下肢血流灌注值，以右下肢/左下肢的血流比率（R/L）表示血流灌注程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ST段抬高幅度

兩組大鼠心梗前心電圖ST段抬高幅度無(wú)明顯差異（P>0.05），與A組相比，B組大鼠在心梗后30 min、再灌注后30 min及再灌注后2 h心電圖ST段明顯回落（P<0.01），見表1。

2.2 心肌酶

與A組相比，B組大鼠CK-MB值明顯降低（P<0.01），見表2。

2.3 心肌梗死面積

兩組大鼠心肌缺血范圍（AAR/LV）無(wú)顯著差異（P>0.05），與A組相比，B組大鼠心肌梗死范圍（IA/LV、IA/AAR）明顯縮?。≒<0.01），見表2。

2.4 下肢血流灌注程度

與A組相比，B組大鼠在預(yù)適應(yīng)前、心梗后30 min及再灌注后2 h其下肢血流灌注比率略有下降，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

3 討論

2001年NCEP ATPⅢ（美國(guó)膽固醇教育計(jì)劃成人治療第三次報(bào)告）提出糖尿病是冠心病的“等危癥”[6]，此后，糖尿病與冠心病的聯(lián)系受到國(guó)內(nèi)外內(nèi)分泌及心血管醫(yī)生的廣泛關(guān)注。相比較單純冠心病患者，合并糖尿病的患者心梗的面積更大、死亡率更高，并且心梗的再發(fā)率也更高[7]。因此，有效防治糖尿病患者的心肌損傷，對(duì)提高其生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。

心梗之后，及時(shí)恢復(fù)缺血區(qū)的血液灌注是減小心梗面積，提高臨床治愈率的重要手段。但再灌注本身也會(huì)對(duì)缺血區(qū)的心肌造成進(jìn)一步的損傷，即缺血/再灌注損傷。缺血預(yù)適應(yīng)（IP）是指機(jī)體組織在經(jīng)歷反復(fù)的短暫的非致死性缺血/缺氧后，對(duì)隨后的長(zhǎng)時(shí)間致死性缺血/缺氧具有高耐受性，這主要表現(xiàn)在實(shí)質(zhì)性細(xì)胞死亡顯著減少，梗死范圍顯著減小，并顯著減輕器官功能障礙，但其缺點(diǎn)是直接作用于靶器官，不適合應(yīng)用于心臟、腦等器官。無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)（NLIP）是指通過對(duì)不太重要的肢體進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)，可產(chǎn)生對(duì)心臟、腦等重要器官的保護(hù)作用，減輕缺血/再灌注損傷，比手術(shù)治療[8-9]和藥物治療[10]更具優(yōu)勢(shì)，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

心電圖ST段抬高是心梗的重要特征，在某種程度上可反映心肌細(xì)胞的損傷程度，該研究表明無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)可明顯降低心梗后ST段抬高幅度，減輕心肌細(xì)胞損傷。心肌酶學(xué)是評(píng)價(jià)心肌梗死的重要指標(biāo)，其中CK-MB主要存在于心肌細(xì)胞，診斷心肌梗死的敏感性達(dá)82.35%、特異性達(dá)94.74%，該研究表明無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)可明顯降低CK-MB升高水平，對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。心肌梗死面積是評(píng)價(jià)心肌缺血/再灌注損傷程度的金標(biāo)準(zhǔn)[11]，該研究證實(shí)無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)可顯著縮小心肌梗死面積，減輕缺血/再灌注損傷程度。臨床上很多糖尿病患者同時(shí)伴有肢體外周血管病變，該研究觀察通過對(duì)已發(fā)生血管病變肢體的缺血預(yù)適應(yīng)，在減輕心肌缺血/再灌注損傷的同時(shí)并未對(duì)病變肢體產(chǎn)生明顯不良影響。

綜上所述，無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)能對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用，且對(duì)已發(fā)生血管病變的下肢無(wú)顯著影響。其產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)制目前尚未完全明了，可能與內(nèi)源性腺苷釋放增加及其受體的激活[12-13]、氧自由基產(chǎn)生減少[14]、炎性細(xì)胞的聚集及心肌細(xì)胞的凋亡減少[15-16]等因素有關(guān)。另外，研究中發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死或再灌注的不同時(shí)期進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)所產(chǎn)生的心肌保護(hù)作用強(qiáng)度可能存在差異，其差異程度仍有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-04-13）