嬰幼兒配方乳粉加工環(huán)境中蠟樣芽孢桿菌多位點(diǎn)序列分型

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(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

嬰幼兒配方乳粉作為母乳替代物，可為嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育提供所必需的物質(zhì)[1]。近年來(lái)嬰幼兒配方乳粉的銷量在我國(guó)乳粉市場(chǎng)中占有重要比例,且需求量呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。嬰幼兒配方乳粉的安全問(wèn)題一直備受關(guān)注,而嬰幼兒配方乳粉加工環(huán)境中的微生物也是潛在的污染來(lái)源[2-3]。蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereussensulato)是一種能產(chǎn)生芽孢或生物膜的食源性致病菌,易引起食物中毒,也是污染嬰幼兒配方乳粉的重要致病菌之一[4]。廣義的蠟樣芽孢桿菌群細(xì)菌(Bacilluscereusgroup)是由生理生化性質(zhì)和基因特征高度相似的多種革蘭氏陽(yáng)性菌組成[5],包括蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)[4]、炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)[4]、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)[5]、蕈狀芽孢桿菌(B.mycoides)[5]、假蕈狀芽孢桿菌(B.pseudomycoides)[6]、耐冷菌韋氏芽孢桿菌(B.weihenstephanensis)[7],以及近幾年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞毒素芽孢桿菌(B.cytotoxicussp.)[8]、圖瓦永芽孢桿菌(B.toyonensis)[9]、B.gaemokensis[9]、B.manliponensis[10]和B.bingmayongensis[9-10]等。

由于蠟樣芽孢桿菌與該菌群內(nèi)的其他種細(xì)菌在形態(tài)特征、生理生化特征和基因序列等方面極為相似,部分新種定義可能存在爭(zhēng)議,因此需結(jié)合國(guó)標(biāo)GB 4789.14-2014中生理生化鑒定試驗(yàn)與其他分子生物學(xué)方法，對(duì)蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行檢測(cè)鑒定,從而減少食品中蠟樣芽孢桿菌的誤檢與漏檢[11]。

蠟樣芽孢桿菌在基因特征的分析上可以借助分子分型技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)通過(guò)測(cè)定6～10個(gè)持家基因的核苷酸序列對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型研究,實(shí)現(xiàn)了不同菌株之間等位基因多樣性的比較[12]。與其他分型方法相比較,MLST技術(shù)建立了一個(gè)專門的數(shù)據(jù)庫(kù)(PubMLST),有利于全球數(shù)據(jù)的共享,便于不同實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)的比對(duì)[13]。同時(shí),MLST可以對(duì)不同來(lái)源的菌株進(jìn)行親緣關(guān)系的探究,分析菌群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與遺傳進(jìn)化關(guān)系,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分型方法的缺點(diǎn),該技術(shù)已逐漸成為細(xì)菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”[14-15]。

本文對(duì)分離自嬰幼兒配方乳粉加工環(huán)境中的84株蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行MLST分析,探究了嬰幼兒配方乳粉加工生產(chǎn)環(huán)境中的分離株的多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,為其后續(xù)的溯源研究和有效防控提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株 84株蠟樣芽孢桿菌 均分離自2014～2015年期間嬰幼兒配方乳粉原輔料及各生產(chǎn)環(huán)節(jié)；根據(jù)GB 4789.14-2014中的菌落形態(tài)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果,結(jié)合16S rRNA基因分析將分離菌株鑒定為蠟樣芽孢桿菌。BHI固體培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;2×Taq PCR MasterMix、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司。

高壓蒸汽滅菌鍋 山東中泰有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;高速冷凍離心機(jī) 上海通達(dá)機(jī)械研究所;9700 PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)Applied Biosystems公司;DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠;UVP凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司;Bcn1360型生物超凈工作臺(tái) 蘇州金大工程設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蠟樣芽孢桿菌分離株的活化與純化培養(yǎng) 將凍存的菌株以2%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)8～12 h。然后將活化后的菌液于BHI瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)12 h,再挑取BHI培養(yǎng)基上的單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。

1.2.2 DNA模版的提取 取2 mL分離菌株的LB培養(yǎng)基菌液,采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取84株蠟樣芽孢桿菌分離株的DNA,提取后于-20 ℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)蠟樣芽孢桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubMLST.org/bcereus/)所提供的七對(duì)持家基因的序列設(shè)計(jì)引物,持家基因glpF、gmk、ilvD、pta、pur、pycA和tpi引物如表1所示,引物由北京諾賽生物科技有限公司合成。

1.2.4 持家基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序 PCR反應(yīng)體系50 μL:正向引物和反向引物各1 μL,DNA模板5 μL,2×Taq PCR Mix 25 μL,ddH2O 18 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,56～59 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸7 min,終產(chǎn)物4 ℃保存[16]。取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠(含EB)上進(jìn)行電泳檢測(cè),電壓和電流分別為 100 V和100 A,電泳時(shí)間為30 min。凝膠成像儀下觀察并拍照,若出現(xiàn)清晰明亮的單一特異性條帶,將產(chǎn)物送至北京諾賽生物科技有限公司純化后進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.5 多位點(diǎn)序列分型 將測(cè)序后的序列用 ContigExpress 軟件進(jìn)行拼接,登錄蠟樣芽孢桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(pubMLST)，對(duì)每株菌的七個(gè)持家基因序列進(jìn)行查詢與比對(duì),得到相應(yīng)的等位基因編碼(Aelle),并按照glpF、gmk、ilvD、pta、pur、pycA、tpi的排列順序，確定菌株的序列型(Sequence type,ST)[16]。若測(cè)序所得的等位基因或序列型未與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的序列完全匹配,則對(duì)該持家基因重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系與條件同1.2.4所述,PCR產(chǎn)物進(jìn)行重新測(cè)序,在MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)重新測(cè)序得到的序列，以確證新的等位基因與序列型,將重復(fù)確證后的等位基因或序列型提交至數(shù)據(jù)庫(kù)，得到新的等位基因編碼與序列型編碼,并獲取相應(yīng)的菌株ID編號(hào)[17]。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析 將蠟樣芽孢桿菌的七個(gè)持家基因序列進(jìn)行拼接，得到長(zhǎng)度為2829 bp的基因序列,利用Mega 7.0軟件對(duì)84株蠟樣芽孢桿菌分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,選擇最大似然算法(Maxmum likelihood algorithm),程序重復(fù)1000次,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18],并選擇B.cereusATCC 14579、B.anthracisATCC 14578、B.thuringiensis ATCC 10792、B.mycoides ATCC 6462、B.pseudomycoidesDSM 12442、B.weihenstephanensisDSM 11821、B.cytotoxicusNVH 391-98、B.toyonensisBCT-7112、B.gaemokensisBL3-6、B.manliponensisBL4-6和B.bingmayongensisFJAT-13831作為參考菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌分離株的DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取84株分離菌株的DNA,部分菌株的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。分離菌株的DNA電泳條帶清晰且無(wú)雜帶,說(shuō)明提取的DNA可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。持家基因的特異性引物均能擴(kuò)增出無(wú)引物二聚體的單一清晰明亮的目標(biāo)條帶,部分?jǐn)U增結(jié)果如圖2所示。

圖1 試驗(yàn)菌株DNA提取電泳圖Fig.1 The electrophoresis results of DNA extracted from part of isolated strains注:M:Marker DL2000;1～5:部分菌株DNA。

圖2 部分菌株的持家基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoresis results of PCR products form part of isolated strains 注:M:Marker DL2000;1～6為部分菌株P(guān)CR產(chǎn)物。

2.2 MLST分型

將84株蠟樣芽孢桿菌的七個(gè)持家基因序列在蠟樣芽孢桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),得到相應(yīng)的等位基因編碼和ST型。未與數(shù)據(jù)庫(kù)完全匹配的等位基因經(jīng)過(guò)確證試驗(yàn)后,得到3個(gè)新的等位基因pur-242、pyc-198、ilv-276。84株蠟樣芽孢桿菌分離菌株被分成如下24個(gè)ST型:ST-24、ST-26、ST-32、ST-62、ST-144、ST-374、ST-999、ST-1119、ST-1243、ST-1284、ST-1333、ST-1334、ST-1335、ST-1336、ST-1337、ST-1338、ST-1339、ST-1340、ST-1341、ST-1342、ST-1343、ST-1344、ST-1345和ST-1347,其中14個(gè)序列型經(jīng)過(guò)重復(fù)PCR及測(cè)序進(jìn)行確證試驗(yàn)后被確認(rèn)為新的ST型,分別是ST-1333、ST-1334、ST-1335、ST-1336、ST-1337、ST-1338、ST-1339、ST-1340、ST-1341、ST-1342、ST-1343、ST-1344、ST-1345和ST-1347,上傳至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)并得到相應(yīng)的ID為2093-2015和2110。84株菌的具體ST型結(jié)果如表2所示。

表2 84株蠟樣芽孢桿菌MLST信息表Table 2 MLST of 84 B.cereus strains

在24個(gè)ST型中,ST-999的菌株為19株,占總數(shù)的22.62%;ST-1343的菌株為13株,占總數(shù)的15.48%;ST-1335與ST-1345的菌株均為6株,各占總數(shù)的7.14%,之后為ST-1344(5株,5.95%)、ST-32(5株,5.95%)、ST-1333(5株,5.95%)、ST-1119(3株,3.57%);6個(gè)ST型均有兩株菌,包括ST-24、ST-26、ST-144、ST-1337、ST-1339和ST-1347;其余10個(gè)ST型均只有1株菌,分別為ST-62、ST-374、ST-1284、ST-1334、ST-1336、ST-1243、ST-1338、ST-1340、ST-1341和ST-1342?？梢娫搵胗變号浞饺榉奂庸きh(huán)境中的優(yōu)勢(shì)ST型為ST-999、ST-1343、ST-1335與ST-1345。

到目前為止,蠟樣芽孢桿菌MLST分型數(shù)據(jù)庫(kù)中共包含了2300多株蠟樣芽孢桿菌,這些蠟樣芽孢桿菌已經(jīng)被分為了1487個(gè)ST型,在這些ST型中一些重要的ST型已經(jīng)被重點(diǎn)報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)ST-26與ST-144在嬰幼兒食品中被檢出,檢出率高達(dá)98%[19]。在本研究中兩株ST-26與兩株ST-144均分離于生產(chǎn)環(huán)節(jié),是較為罕見的嘔吐型蠟樣芽孢桿菌,這種菌株在環(huán)境中檢出率一般低于1%,并且ST-26在數(shù)據(jù)庫(kù)中所有的嘔吐型菌株中是最常見的，且占據(jù)著較大的比例(73%)。嘔吐型菌株能產(chǎn)生導(dǎo)致食物中毒的嘔吐毒素(cereulide)[20],這種毒素形成之后，很難在食品加工過(guò)程中和在人體內(nèi)的胃消化過(guò)程中被消滅破壞,易引起食物中毒的集中爆發(fā),其潛伏期非常短[21],主要產(chǎn)生嘔吐癥狀,有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)頭暈、四肢無(wú)力的癥狀[22]。因此,在生產(chǎn)區(qū)域被檢測(cè)到的ST-26與ST-144應(yīng)該引起我們對(duì)安全生產(chǎn)的高度重視,注意保持加工環(huán)境的良好衛(wèi)生狀況,特別是噴霧干燥環(huán)節(jié),流化床以及包裝環(huán)節(jié)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

84株蠟樣芽孢桿菌基于七個(gè)持家基因拼接的全長(zhǎng)為2829 bp的最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。該系統(tǒng)發(fā)育樹揭示了蠟樣芽孢桿菌群微生物明確的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,該嬰幼兒配方乳粉加工環(huán)境中所分離的24個(gè)ST型和蠟樣芽孢桿菌群中的11個(gè)種都相互保持了一定的距離,而在這11個(gè)種中,24個(gè)ST型和B.cereus、B.anthracis、B.thuringiensis這三個(gè)種顯示了更近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,同蠟樣芽孢桿菌群中的另外8個(gè)種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。ST-24、ST-999和ST-921(B.cereusATCC 14579)具有更近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,而根據(jù)B.cereusMLST數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì),這些相近的ST之間只相差3～7個(gè)堿基,由于MLST分型能夠反應(yīng)整個(gè)基因組的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,因此ST-24、ST-999和ST-921的菌株很可能在整個(gè)基因組層面的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系也比較相近。新發(fā)現(xiàn)的ST-1340、ST-1334、ST-1347、ST-1343和ST-1344系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近,且這些ST型均分離自生產(chǎn)內(nèi)包環(huán)節(jié)和包裝內(nèi)包環(huán)節(jié),表明這兩個(gè)加工環(huán)節(jié)的ST型在進(jìn)化上具有親緣關(guān)系,可能存在不同環(huán)節(jié)交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。

圖3 84株蠟樣芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of 84 B. cereus strains

3 結(jié)論

本文將84株分離自嬰幼兒配方乳粉加工環(huán)境中的蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型,共分為24個(gè)ST型,其中14個(gè)ST型是首次發(fā)現(xiàn)的ST型,分別為ST-1333、ST-1334、ST-1335、ST-1336、ST-1337、ST-1338、ST-1339、ST-1340、ST-1341、ST-1342、ST-1343、ST-1344、ST-1345和ST-1347,同時(shí)pur-242,pyc-198,ilv-276是三個(gè)新發(fā)現(xiàn)的等位基因。ST-999、ST-1343、ST-1335與ST-1345是該嬰幼兒配方乳粉加工環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)ST型。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析,24個(gè)ST型和B.cereus、B.anthracis、B.thuringiensis這三個(gè)種在基因?qū)用娴挠H緣關(guān)系較近,與蠟樣芽孢桿菌群中的其余8個(gè)種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?？傮w而言,利用MLST技術(shù)及系統(tǒng)發(fā)育分析研究了嬰幼兒配方乳粉加工環(huán)境中的蠟樣芽孢桿菌,豐富了蠟樣芽孢桿菌的數(shù)據(jù)庫(kù),為進(jìn)一步研究嬰幼兒配方乳粉加工環(huán)境中的蠟樣芽孢桿菌的多樣性和溯源防控提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。