防治藍(lán)莓棒狀擬盤(pán)多毛孢菌化學(xué)藥劑的室內(nèi)篩選

薛德勝 邵兆浩 李保華 王彩霞

摘要：為明確山東省藍(lán)莓葉斑病和根腐病病原菌種類并篩選有效防治藥劑，采用組織分離法獲得菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合柯赫氏法則對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，同時(shí)測(cè)試了8種藥劑對(duì)病原菌生長(zhǎng)及6種藥劑對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果顯示，引起山東省藍(lán)莓葉斑病和根腐病的病原菌均為棒狀擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）；苯醚甲環(huán)唑和福美雙對(duì)P. clavispora菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，EC50均為1.97 mg/L，其次為苯甲·丙環(huán)唑，EC50為2.70 mg/L；福美雙對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制效果最顯著，EC50為0.004 mg/L，其次為苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇；甲基硫菌靈對(duì)該菌幾乎沒(méi)有抑制作用。

關(guān)鍵詞：棒狀擬盤(pán)多毛孢；藍(lán)莓；殺菌劑；抑菌效果

中圖分類號(hào)：S436.639 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）09-0115-04

Abstract In order to clarify the pathogens and screen out the effective fungicides for blueberry leaf spot and root rot diseases in Shandong Province， the strains were obtained using tissue isolation method and identified based on morphological， molecular biology techniques and Koch s Rule. The inhibitory effects of 8 kinds of fungicides on mycelia growth and 6 kinds of fungicides on spore germination were determined. The results showed that the pathogen of blueberry leaf spot and root rot diseases in Shandong Province was Pestalotiopsis clavispora. Difenoconazole and thiram had the best inhibition on mycelia growth，and both the EC50 were 1.97 mg/L， followed by difenoconazole·propiconazole with the EC50 as 2.70 mg/L. The thiram had the best inhibition on conidia germination and the EC50 was 0.004 mg/L， followed by difenoconazole and tebuconazole. However， thiophanate-methyl had almost no inhibition effects on the pathogen.

Keywords Pestalotiopsis clavispora； Blueberry； Fungicides； Inhibitory effect

藍(lán)莓（Vaccinium spp.）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生小灌木漿果類果樹(shù)，具有很好的營(yíng)養(yǎng)保健作用[1]，1983年引入我國(guó)并進(jìn)行栽培研究[2]。山東半島地區(qū)因氣候和土壤適合藍(lán)莓生長(zhǎng)，青島膠南、威海乳山、日照五蓮等地先后建立藍(lán)莓生產(chǎn)基地，促進(jìn)了山東半島地區(qū)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[3]。近年來(lái)，隨著我國(guó)藍(lán)莓栽培面積的不斷擴(kuò)大，病害也隨之傳播蔓延并逐年加重，成為制約藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要限制因素[4-6]。

2016年和2017年8—9月，山東半島藍(lán)莓種植基地苗圃內(nèi)葉斑病和根腐病大發(fā)生，造成大量苗木死亡。為明確藍(lán)莓兩種病害的病原菌種類及不同藥劑對(duì)病原菌室內(nèi)抑菌效果，本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)確定病原菌種類，并通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法對(duì)多種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)篩選，以期為藍(lán)莓葉斑病和根腐病有效防控提供參考依據(jù)。1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病樣及植物：2016年和2017年8—9月在山東半島藍(lán)莓種植基地采集發(fā)病藍(lán)莓植株，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。供試藍(lán)莓品種為公爵（cv. Duke）。

供試藥劑：根據(jù)生產(chǎn)上常用殺菌劑，選取其中8種為供試藥劑（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓葉斑病和根腐病病原菌鑒定 從發(fā)病藍(lán)莓葉片和根部取樣，采用組織分離法進(jìn)行病原菌的分離和純化，分別獲得3個(gè)菌株，保存于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)病害流行與綜合防控實(shí)驗(yàn)室。25℃恒溫暗培養(yǎng)，定期觀察菌落生長(zhǎng)情況及產(chǎn)孢特征，根據(jù)形態(tài)學(xué)初步鑒定病菌。提取真菌基因組DNA[7]，利用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2 × TSINGKE Master Mix 12.5 μL，ITS1/ITS4（10 μmol/L）各1 μL，DNA 1 μL，超純水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后，交由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析并對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。最后根據(jù)科赫氏法則回接健康藍(lán)莓葉片和根部驗(yàn)證病原的致病性。

1.2.2 菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn) 采用生長(zhǎng)速率法[8]，測(cè)試8種殺菌劑對(duì)病菌的毒力。在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌水將8種殺菌劑分別配成不同濃度梯度的藥液，將49 mL PDA融化并冷卻至45℃左右，每瓶PDA加入1 mL藥液，充分搖勻，制成最終濃度（表1）的含藥PDA，等量倒入直徑為5.5 cm 的培養(yǎng)皿中，用5 mm打孔器在活化好的菌落邊緣打取菌餅，接種于含不同藥劑濃度PDA平板中央，置于25℃恒溫暗培養(yǎng)，以不含藥劑的無(wú)菌水處理作空白對(duì)照，每處理重復(fù)3次。3 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算毒力回歸方程。

菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑） × 100 。

1.2.3 孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn) 通過(guò)孢子萌發(fā)試驗(yàn)[8]，測(cè)試6種殺菌劑對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響。配置分生孢子懸浮液濃度至1.0×106個(gè)/mL，分別吸取孢子懸浮液和表1中不同濃度殺菌劑溶液的兩倍液各50 μL，滴于潔凈的單凹載玻片上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以無(wú)菌水為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。12 h后在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)各處理三個(gè)視野中的分生孢子萌發(fā)率，并計(jì)算毒力回歸方程。

孢子萌發(fā)率（%）=萌發(fā)孢子量/總孢子量×100 ；

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（1-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100 。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓葉斑病和根腐病病原菌鑒定

從典型癥狀的藍(lán)莓病葉和病根上通過(guò)組織分離法分別獲得3個(gè)菌株，菌落均為圓形，呈白色絨毛狀，菌落正面未有明顯色素產(chǎn)生，背面呈淡黃色；培養(yǎng)3 d 時(shí)，菌落上開(kāi)始形成黑色分生孢子盤(pán)，隨后溢出分生孢子角，培養(yǎng)7 d時(shí)，可見(jiàn)大量的分生孢子盤(pán)和分生孢子角；成熟分生孢子呈紡錘形，由5個(gè)細(xì)胞組成，頂端具有2 ～ 4根透明附屬絲，基部1根附屬絲，3個(gè)中間細(xì)胞為橄欖色，比末端細(xì)胞顏色深。根據(jù)菌落和分生孢子形態(tài)特征，初步鑒定該病原菌為棒狀擬盤(pán)多毛孢菌。通過(guò)對(duì)菌株ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)，均獲得約600 bp的目標(biāo)片段（圖1）。純化PCR后分別進(jìn)行測(cè)序，序列分析結(jié)果顯示兩種病菌菌株的ITS序列完全一致，說(shuō)明為同一種真菌，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，與不同來(lái)源棒狀擬盤(pán)多毛孢的同源性均在99%以上。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將藍(lán)莓葉斑病和根腐病病原菌鑒定為棒狀擬盤(pán)多毛孢。將菌株回接后，兩者均發(fā)病，且發(fā)病癥狀與田間一致，后期產(chǎn)生分生孢子盤(pán)和分生孢子，再次組織分離和進(jìn)行挑單孢，均獲得相同菌株。

2.2 化學(xué)藥劑篩選

8種化學(xué)藥劑對(duì)病原菌均有不同程度的抑制作用，且隨藥劑濃度升高抑制作用逐漸增強(qiáng)（圖2）。表2結(jié)果顯示，三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑和有機(jī)硫類殺菌劑福美雙對(duì)病原菌的抑制效果最明顯，EC50均為1.97 mg/L；其次為三唑類殺菌劑苯甲·丙環(huán)唑和二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲，EC50分別為2.70 mg/L和5.63 mg/L；抑菌效果最差的為苯并咪唑類殺菌劑甲基硫菌靈，其EC50高達(dá)334 146.81 mg/L。

2.3 孢子萌發(fā)試驗(yàn)

6種殺菌劑對(duì)孢子萌發(fā)均有一定的抑制效果，且隨著濃度增加分生孢子萌發(fā)率降低。表3結(jié)果顯示，有機(jī)硫類殺菌劑福美雙和三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑?qū)Ψ稚咦用劝l(fā)的抑制效果最明顯，EC50分別為0.004 mg/L和0.088 mg/L；其次為三唑類殺菌劑戊唑醇，EC50為1.824 mg/L；抑菌效果最差的為苯并咪唑類殺菌劑甲基硫菌靈，EC50高達(dá)34 283.529 mg/L。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、rDNA-ITS序列分析并結(jié)合致病性測(cè)定，將引起山東省藍(lán)莓葉斑病和根腐病的病原菌鑒定為棒狀擬盤(pán)多毛孢。已有研究表明，擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsis）真菌在自然界中廣泛存在，種類繁多，多數(shù)種可引起植物病害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。其中，棒狀擬盤(pán)多毛孢為多種作物葉斑病及根腐病病原菌[10，11]，也可以侵染藍(lán)莓引起病害，國(guó)外報(bào)道該病菌可以引起枝條潰瘍和枝枯病[12，13]，在國(guó)內(nèi)可引起枝枯病[14，15]等。本研究證實(shí)棒狀擬盤(pán)多毛孢是引致藍(lán)莓葉斑病和根腐病的病原菌，并首次對(duì)該菌進(jìn)行藥劑篩選。

雖然棒狀擬盤(pán)多毛孢菌可引起較為嚴(yán)重的病害，但針對(duì)該病原菌有效化學(xué)藥劑篩選的研究較少，尤其在藍(lán)莓病害上的藥劑篩選未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定不同殺菌劑對(duì)棒狀擬盤(pán)多毛孢的抑制效果，篩選出了高毒力殺菌劑。三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑和有機(jī)硫類殺菌劑福美雙對(duì)棒狀擬盤(pán)多毛孢的菌絲生長(zhǎng)抑制效果最好，同時(shí)對(duì)分生孢子萌發(fā)抑制效果也最好；苯并咪唑類殺菌劑甲基硫菌靈在生產(chǎn)上廣泛使用，但對(duì)藍(lán)莓棒狀擬盤(pán)多毛孢的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)幾乎沒(méi)有抑制作用。其它不同類型殺菌劑的抑制效果、所篩選藥劑對(duì)藍(lán)莓葉斑病和根腐病的田間防效及其持效期還有待進(jìn)一步測(cè)試。值得注意的是，化學(xué)藥劑過(guò)量使用會(huì)造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)、影響食品安全、破壞生態(tài)環(huán)境等，因此，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有害生物的防控需綜合應(yīng)用各項(xiàng)防治措施并結(jié)合精準(zhǔn)防控技術(shù)，從而降低化學(xué)農(nóng)藥的使用量。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 張玉萍. 越橘的保健作用及其在我國(guó)的開(kāi)發(fā)利用前景[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 34（4）：22-25.

[2] 王輝， 王鵬云， 王蜀， 等. 我國(guó)藍(lán)莓的發(fā)展現(xiàn)狀及前景[J]. 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究， 2008， 29（2）：250-253.

[3] 吳林. 山東沿海地區(qū)藍(lán)莓發(fā)展概況[J]. 煙臺(tái)果樹(shù)， 2011（4）：1-3.

[4] Luan Y S， Shang Z T， Su Q， et al. First report of a Pestalotiopsis sp. causing leaf spot of blueberry in China [J]. Plant Disease， 2008， 92（1）：171.

[5] 岳清華， 趙洪海， 梁晨， 等. 藍(lán)莓?dāng)M莖點(diǎn)枝枯病的病原[J]. 菌物學(xué)報(bào)， 2013， 32（6）：959-966.

[6] 石凌波， 李媛， 費(fèi)諾亞， 等. 藍(lán)莓?dāng)M盤(pán)多毛孢葉斑病病原菌鑒定[J]. 中國(guó)南方果樹(shù)， 2017， 46（1）：24-28.

[7] 張穎慧， 魏東盛， 邢來(lái)君， 等. 一種改進(jìn)的絲狀真菌DNA提取方法[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2008， 35（3）：466-469.

[8] 余賢美， 王潔， 侯長(zhǎng)明， 等. 16種殺菌劑對(duì)柿樹(shù)炭疽病菌哈銳炭疽菌的抑制效果[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 50（3）：90-93.

[9] 韋繼光， 徐同， 潘秀湖， 等. 擬盤(pán)多毛孢屬的分類學(xué)研究進(jìn)展[J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)， 2006， 25（1）：78-85.

[10] 趙景楠， 馬喆， 劉正坪， 等. 草莓?dāng)M盤(pán)多毛孢葉斑病的病原菌[J]. 菌物學(xué)報(bào)， 2016， 35（1）：114-120.

[11] 趙宇， 錢(qián)恒偉， 徐鵬程， 等. 青島市草莓根腐病病原菌分離及鑒定[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊， 2016， 36（1）：43-46.

[12] Espinoza J G， Briceo E X， Keith L M， et al. Canker and twig dieback of blueberry caused by Pestalotiopsis spp. and a Truncatella sp. in Chile [J]. Plant Disease， 2008， 92（10）：1407-1414.

[13] González P， Alaniz S， Montelongo M J， et al. First report of Pestalotiopsis clavispora causing dieback on blueberry in Uruguay [J]. Plant Disease， 2012， 96（6）：914.

[14] 趙洪海， 岳清華， 梁晨. 藍(lán)莓?dāng)M盤(pán)多毛孢枝枯病的病原菌[J]. 菌物學(xué)報(bào)， 2014， 33（3）：577-583.

[15] Chen Y， Zhang A F， Yang X， et al. First report of Pestalotiopsis clavispora causing twig blight on highbush blueberry （Vaccinium corymbosum） in Anhui Province of China [J]. Plant Disease， 2016， 100（4）：859.