結(jié)核分枝桿菌調(diào)節(jié)miRNAs及circRNAs抗細(xì)胞自噬機(jī)制的生物分析

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結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis, MTB)是結(jié)核病的病原體，因具有超強(qiáng)的抵抗力而在機(jī)體內(nèi)難以被消滅，不斷刺激機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)并逐漸形成結(jié)核肉芽腫從而發(fā)展成慢性疾病，其較強(qiáng)的生存力和抗巨噬細(xì)胞自噬、逃避免疫殺傷等機(jī)制有密切關(guān)系。自噬是指吞噬了胞內(nèi)成分的囊泡和溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包含的內(nèi)容物的過程[1]；自噬可以清除自身蛋白質(zhì)、細(xì)胞器，還可以清除胞內(nèi)感染的微生物，與炎癥相關(guān)，是十分重要的細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象[2]。自噬相關(guān)基因是指能表達(dá)參與細(xì)胞內(nèi)自噬過程的相關(guān)蛋白的一系列基因，其表達(dá)程度受microRNA(miRNA)的調(diào)節(jié)。miRNA是一種長度約18～22 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，通過靶向基因的3′UTR區(qū)域，降解靶基因或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[3-4]；miRNA的表達(dá)水平又受其上游分子Circular RNA(circRNA)、Long non-coding RNA(lncRNA)的調(diào)節(jié)。circRNA不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾巴，是以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子[5]。circRNA起miRNA海綿作用，其內(nèi)含miRNA應(yīng)答元件并可與之結(jié)合，阻止miRNA抑制靶基因，上調(diào)相應(yīng)基因表達(dá)[6]。 近年來研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在肺結(jié)核患者體內(nèi)顯著升高或降低，其通過靶向巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因表達(dá)從而抑制自噬，增強(qiáng)MTB的抗自噬能力和生存力；而實(shí)驗(yàn)抑制相關(guān)miRNA的表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞自噬清除MTB的能力，因此探索潛在的相關(guān)miRNA及其調(diào)控分子在疾病的診斷和治療中具有巨大意義。本文依據(jù)文獻(xiàn)報道及實(shí)驗(yàn)分析預(yù)測了與結(jié)核抗自噬相關(guān)的自噬基因，miRNAs，circRNAs，并闡述其相互作用通路，為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌通過調(diào)控miRNAs、circRNAs抗細(xì)胞自噬奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的差異自噬基因篩選 利用GEO數(shù)據(jù)庫 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 檢索結(jié)核感染相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，篩選4個實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行分析比較[7-10]。選擇樣本的標(biāo)準(zhǔn)為結(jié)核分枝桿菌肺部感染人或小鼠，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)感染時間長。對每個樣本的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，制作Volcano Plot圖(火山圖)。從目標(biāo)結(jié)果中篩選自噬相關(guān)基因，多個樣本結(jié)果選取交集，初步得到差異基因[11]；用GeneMANIA工具[11](http://genemania.org)、String網(wǎng)站[12](https://string-db.org) (形成差異基因間蛋白質(zhì)交互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，觀察這些自噬基因的PPI作用方式及聯(lián)系程度，用Cytoscape軟件 (www.cytoscape.org)[13]對網(wǎng)絡(luò)模型數(shù)據(jù)加工處理，制作基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)圖，將交聯(lián)圖中聯(lián)系較為密切的自噬蛋白群篩選出來，再合并一些通過文獻(xiàn)挖掘得到的自噬基因，組成最終差異的自噬基因群；并用GCBI網(wǎng)站 (https://www.gcbi.com.cn/gclib/html/index) 制作多基因雷達(dá)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖將基因群聯(lián)系起來。

1.2差異自噬基因-miRNAs相互作用的生物信息學(xué)預(yù)測 選擇基因雷達(dá)群中存在廣泛聯(lián)系的差異自噬基因，采用miRWalk 2.0 (http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.html)[14]軟件進(jìn)行Gene-miRNA分析。為預(yù)測靶向自噬基因的miRNA準(zhǔn)確度，選擇TargetScan、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid共5個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的miRNA結(jié)果交集做為預(yù)測結(jié)果。篩選條件設(shè)置為P<0.05, 最小種子序列長度為7 mer，靶基因結(jié)合區(qū)域?yàn)?′UTR。得到的數(shù)據(jù)結(jié)果用Cytoscape軟件進(jìn)行處理及圖形繪制，制作最終的Gene-miRNAs交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖。差異自噬基因-miRNA網(wǎng)絡(luò)分析選出與自噬基因交聯(lián)多的miRNA，文獻(xiàn)挖掘驗(yàn)證miRNA的表達(dá)差異，TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/)[15]、miRanda (http://34.236.212.39/microrna/home.do)[16]檢驗(yàn)miRNA與靶基因保守型。

1.3miRNAs-circRNAs相互作用的生物信息學(xué)預(yù)測 用starBase v2.0 (http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)[17]的“miRNA-circRNA”工具預(yù)測篩選出來的miRNA的上游circRNA分子，用Cytoscape軟件制作miRNAs-circRNAs交聯(lián)圖。利用交聯(lián)圖取各miRNA預(yù)測結(jié)果交集，得到相關(guān)circRNA分子。結(jié)合文獻(xiàn)挖掘，選出表達(dá)發(fā)生顯著差異的circRNAs作為參與自噬調(diào)控的關(guān)鍵circRNA分子。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析處理，統(tǒng)計(jì)方法采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的差異自噬基因篩選 樣本的Volcano Plot圖分析結(jié)果見圖1，篩選條件為P<0.05, 表達(dá)下調(diào)2倍以上，目標(biāo)結(jié)果用橙色顯示。 結(jié)果中挑選出的自噬相關(guān)基因，以KEGG數(shù)據(jù)庫 (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html) Autophagy-animal通路中已有的基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)。GeneMANIA工具、String網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)這些基因表達(dá)蛋白間還存在非常復(fù)雜的相互作用，參考KEGG、Reactome (https://reactome.org)[18]的自噬通路發(fā)現(xiàn)在MTB感染后表達(dá)顯著變化的自噬基因功能主要集中在自噬囊泡的形成過程，表現(xiàn)出很高的特異性。從Volcano Plot圖表達(dá)差異顯著的基因中挑選出穩(wěn)定保守的自噬相關(guān)基因，用String網(wǎng)站分析得到這些基因表達(dá)蛋白交聯(lián)作用圖，并用Cytoscape細(xì)節(jié)處理后結(jié)果見圖2：更加直觀的展示了參與MTB調(diào)節(jié)自噬的相關(guān)基因及基因間的聯(lián)系。差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因文獻(xiàn)挖掘結(jié)果見表1：這些自噬基因在MTB感染后發(fā)生顯著上調(diào)或下調(diào)，并且都已實(shí)驗(yàn)證實(shí)受miRNA調(diào)節(jié)[19-33]。從圖2中篩選出10個自噬相關(guān)基因(BECN1, ATG3, ATG4b, ATG5, ATG7, ATG12, ATG14, ATG16L1, UVRAG, WIPI1)，合并6個經(jīng)文獻(xiàn)挖掘的自噬相關(guān)基因(ATG10, ULK1, DRAM1, VMP1, LAMP3, MAP1LC3A)，最終篩選出的基因群的雷達(dá)網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)圖見圖3。

過濾閾值：差異倍數(shù)FC>2, |log2(FC)|>1；P<0.05, -log10 (P)>1.30；中間藍(lán)色的分割線表示FC為1；分割線左邊表示下調(diào)的基因，右邊表示上調(diào)的基因；橙色區(qū)表示表達(dá)下調(diào)倍數(shù)>2的基因圖1 MTB感染的細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 The volcano plot of the differentiated expression of genes in MTB-infected cells

2.2差異自噬基因-miRNAs相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析與文獻(xiàn)挖掘 基因-miRNAs網(wǎng)絡(luò)分析圖結(jié)果見圖4；將表中與基因交聯(lián)數(shù)較多(≥3)的miRNA挑選出來，基本情況見表2；部分miRNA在MTB感染后的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)[34-35]，部分miRNA與自噬基因的作用關(guān)系在其他非結(jié)核領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)中已經(jīng)驗(yàn)證[36]。文獻(xiàn)挖掘出已實(shí)驗(yàn)證實(shí)的結(jié)核感染細(xì)胞后差異表達(dá)的自噬基因-miRNA相互作用關(guān)系，詳細(xì)結(jié)果見表1。

基因節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺表示其交聯(lián)作用的復(fù)雜程度圖2 MTB感染細(xì)胞內(nèi)差異自噬基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The interaction network of differentiated autophagy related genes in MTB-infected cells

淺藍(lán)色的點(diǎn)表示自噬蛋白，黃色的點(diǎn)“GABARAP”表示其和自噬蛋白的交聯(lián)作用最復(fù)雜圖3 自噬基因間相互作用雷達(dá)網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The autophagy genes in gene radar of interaction network

基因節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺表示其與其他miRNA交聯(lián)作用的復(fù)雜程度，已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miRNA和基因的相互作用用紅線表示圖4 差異自噬基因-miRNAs相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 The interaction network between differentiated autophagy genes and miRNAs

表1 MTB感染細(xì)胞內(nèi)受miRNA調(diào)節(jié)的自噬基因文獻(xiàn)挖掘結(jié)果Tab.1 The literature outcome of autophagy genes regulated by miRNA in MTB-infected cells

*H37Rv:MTB強(qiáng)毒株；BCG：卡介苗；H37Ra:MTB減毒株。

表2 篩選出的miRNAs和自噬相關(guān)基因間的相互作用Tab.2 The interaction information between the filtered miRNAs and autophagy related genes

2.3miRNAs-circRNAs相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析 經(jīng)驗(yàn)證的miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-30a-5p, miR-33-5p共4種可信度高的miRNA，預(yù)測對應(yīng)的circRNAs，篩選閾值為最高可信度(very high stringency≥5)，4種miRNAs的交聯(lián)結(jié)果見圖5(a)。交聯(lián)后共得到6個同時靶向4種關(guān)鍵miRNA的circRNA(圖5(a)最上處的6個紫色節(jié)點(diǎn)代表該6種circRNA)，分別為SHOC2_hsa-circRNA1108, UBE3C_hsa-circRNA7333, RPA2_hsa-circRNA 8391, GIGYF1_hsa-circRNA15246, AFF4_hsa-circRNA14411, CLTC_hsa-circRNA3463，見圖5(b)。此外交聯(lián)圖中的SLC30A7_hsa-circRNA414, UBFD1_hsa-circRNA2908, CAMLG_hsa-circRNA6439已經(jīng)被證實(shí)在結(jié)核感染相關(guān)實(shí)驗(yàn)中表達(dá)顯著差異，具體結(jié)果見表3[37-40]。將篩選閾值調(diào)整到中等時(medium stringency≥2)，發(fā)現(xiàn)circRNA686、circRNA1937、circRNA7851、circRNA12825靶向性強(qiáng)且表達(dá)差異顯著，但circRNA686不利于MTB抗自噬；此外hsa-circRNA6439還靶向miR-30a-5p, 其抗自噬功能尤為顯著。綜上，將整個通路參與自噬調(diào)控的重要分子整理歸納，MTB抗細(xì)胞自噬的整個調(diào)控過程“MTB-Gene-miRNA/circRNA-Gene”示意圖見圖6。

(a)miRNAs與circRNAs交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)整體布局;(b)框架內(nèi)的紫色節(jié)點(diǎn)表示差異表達(dá)的關(guān)鍵circRNAs圖5 miRNAs-circRNAs間的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 The interaction network between miRNAs and circRNAs

紅色字體表示的circRNAs是關(guān)鍵RNA圖6 MTB抗巨噬細(xì)胞自噬機(jī)制圖Fig.6 The schematic diagram about MTB resistance to the autophagy in macrophage

3 討 論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，以肺部感染最為常見。近幾年來結(jié)核病越來越難以治療，這和其本身出現(xiàn)耐藥性及頑強(qiáng)的抵抗力密切相關(guān)。結(jié)核分枝桿菌抗細(xì)胞自噬是增強(qiáng)其在細(xì)胞內(nèi)生存力的重要機(jī)制，其能阻止細(xì)胞自噬體的形成或逃避自噬溶酶體吞噬從而一直存在于細(xì)胞內(nèi)免于殺傷[41]。通過大量的生物信息學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)感染結(jié)核分枝桿菌后細(xì)胞有大量自噬相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，其中有明顯差異的基因共18個，見圖2。經(jīng)過大量文獻(xiàn)挖掘，從中選出一些可靠的自噬基因并增加一些其他實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的自噬基因，組成共16個自噬關(guān)鍵基因，見圖3(雷達(dá)中藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表的基因)。通過差異自噬基因-miRNAs交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖我們發(fā)現(xiàn)了miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-30a-5p, miR-33-5p共4種可信度較高的關(guān)鍵miRNA，且這些miRNA和自噬高度相關(guān)且有實(shí)驗(yàn)報道[20-21,24-26]。通過miRNA-circRNAs交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)了6種潛在的circRNA及2種重要的circRNA(見圖5b)，作為miRNA上游分子它們同時靶向上述4種miRNA，抑制miRNA的基因沉默作用，在自噬作用中很可能起重要作用。

表3 與MTB抗自噬相關(guān)的差異表達(dá)的circRNAsTab.3 The differentiated expressed circRNAs contributing to MTB resistance to autophagy

圖1顯示MTB感染巨噬細(xì)胞后樣本中大量基因表達(dá)下調(diào)，這和MTB某些成分對巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。實(shí)際上，MTB被巨噬細(xì)胞吞噬進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，通過自身特異蛋白或分泌蛋白(如ESAT-6等)作用于宿主基因組，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)等進(jìn)而調(diào)整其他基因表達(dá)，直接調(diào)節(jié)自噬基因或先調(diào)節(jié)miRNA進(jìn)而間接控制自噬相關(guān)基因的表達(dá)[42-43]。如表1所示，近幾年研究發(fā)現(xiàn)miRNA在MTB抗細(xì)胞自噬方面有重要作用，人和小鼠細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也基本一致。如圖6所示，結(jié)核桿菌可能通過上調(diào)上述4種miRNA，miRNA又形成RNA沉默復(fù)合體(miRISC)靶向自噬基因的mRNA，導(dǎo)致mRNA降解從而翻譯自噬蛋白[44]。細(xì)胞缺少自噬蛋白便無法合成吞噬泡(Phagophore)，成膜過程發(fā)生障礙從而自噬體(Autophagosome)減少，溶酶體(lysosome)無法和自噬體融合，自噬溶酶體(Autophagolysosome)合成下降，MTB逃避吞噬最終生存下來[45]；相反自噬恢復(fù)就會增強(qiáng)MTB的清除[46]。而circRNA能夠抑制miRNA，發(fā)揮miRNA海綿的作用，從而阻止miRNA抑制自噬的作用, 有些差異表達(dá)的circRNA還是潛在的診斷標(biāo)志物[37-38]。在圖5(a)中靶向miR-30a-5p的SLC30A7_hsa-circRNA414，分別靶向miR-20a-5p及miR-17-5p的UBFD1_hsa-circRNA2908和CAMLG_hsa-circRNA6439三個分子已被相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在活動肺結(jié)核血中分別上調(diào)2倍以上，5倍以上和10倍以上；其中UBFD1_hsa-circRNA2908，CAMLG_hsa-circRNA6439尤為敏感，hsa-circRNA6439還能靶向miR-30a-5p而增強(qiáng)自噬，它們很有可能是結(jié)核領(lǐng)域調(diào)控自噬的關(guān)鍵circRNA成員及相關(guān)診斷標(biāo)志物[37,39]。另6種多交聯(lián)的circRNA在自噬調(diào)節(jié)方面可能也發(fā)揮重要作用，但還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前有關(guān)MTB和circRNA的調(diào)控作用關(guān)系仍不是很清楚，circRNA在巨噬細(xì)胞感染MTB后的表達(dá)變化和其在細(xì)胞內(nèi)的具體作用有待更進(jìn)一步的研究，本文為研究其抗自噬相關(guān)作用提供一定思路。參與自噬調(diào)控的上述4種miRNA都已實(shí)驗(yàn)證實(shí)在MTB感染的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)含量發(fā)生顯著差異，且在人體血清樣本也已證明含量顯著變化，這為利用miRNA作為潛在的新型無創(chuàng)診斷生物標(biāo)志物提供一定依據(jù)[20-21,24-26]。此外，將關(guān)鍵circRNAs和miRNAs作為藥物作用的治療靶點(diǎn)，通過上調(diào)或下調(diào)相關(guān)分子從而增強(qiáng)細(xì)胞自噬功能，巨噬細(xì)胞清除MTB能力大大將會增強(qiáng)，這為尋找藥物作用靶點(diǎn)提供新思路和重要依據(jù)。