Chinese 1型弓形蟲在終宿主家貓腸內(nèi)發(fā)育的研究

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弓形蟲是一種食源性和水源性的人獸共患寄生蟲，可以感染幾乎所有的恒溫動物[1]。中國和全世界分別約有8 %和30 %的人患有弓形蟲病[1-2]，多數(shù)健康人感染弓形蟲時沒有臨床癥狀，但對孕婦和免疫功能低下的患者有嚴(yán)重危害[3]。貓科動物是弓形蟲的終末宿主，貓科動物攝入含有活性的弓形蟲包囊的肉類食物時，包囊在貓消化道內(nèi)經(jīng)酸性胃蛋白酶作用釋放出緩殖子入侵到小腸上皮細(xì)胞，形成裂殖體進(jìn)行無性生殖和雌、雄配子體進(jìn)行有性生殖，可排出數(shù)百萬個的弓形蟲卵囊，污染水源和土壤，并且可在自然條件下存活數(shù)年，對人類及其它動物造成危害[4-5]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，我國弓形蟲以Chinese1(ToxoDB#9)型為主[6]，但其在貓?bào)w內(nèi)的生殖過程尚未見報(bào)道。典型的弓形蟲基因分型包括3個型，Ⅱ和Ⅲ型的致病性較弱，Ⅰ型蟲株毒力最強(qiáng)，可以在感染后4～15 d引起小鼠急性死亡[7]。本研究選用TgCatCHn4(Chinese1)株弓形蟲的包囊和RH株(Ⅰ型，ToxoDB#3)弓形蟲的速殖子分別感染家貓和Balb/c小鼠，觀察弓形蟲在家貓回腸上皮細(xì)胞的有性生殖和無性生殖過程的蟲體形態(tài)、小鼠主要臟器的病理損傷特點(diǎn)及速殖子形態(tài)，以期為弓形蟲在終末宿主和中間宿主的病理診斷和入侵機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1弓形蟲蟲株和抗體 弓形蟲RH株受贈于蘭州獸醫(yī)研究所朱興全教授，TgCatCHn4分離于貓組織[8]，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室小鼠傳代保存。兔抗弓形蟲多克隆抗體由美國農(nóng)業(yè)部Dubey實(shí)驗(yàn)室饋贈，小鼠Specific HRP/DAB(ABC)Detection IHC kit 購自abcam公司(貨號: ab64264)，按照使用說明書進(jìn)行操作。

1.2試驗(yàn)動物及處理 弓形蟲檢測為陰性的3月齡貓1只，飼喂感染TgCatCHn4蟲株小鼠的大腦和肌肉組織，每日收集貓糞便，糖漂法檢查糞便中的卵囊[1]。貓?jiān)诟腥綯gCatCHn4蟲株后10 d(Days Post Inoculation, DPI)時安樂死，取貓回腸制作組織涂片，回腸固定于10%的福爾馬林溶液中。

選用20只弓形蟲檢測陰性的雌性性成熟的Balb/c小鼠 (購于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心)。將小鼠隨機(jī)分為2組(感染組和對照組，每組10只小鼠)。小鼠自由采食清潔級飼料，飲用滅菌水。感染組小鼠每只分別腹腔感染弓形蟲RH株1×105速殖子，0.2 mL/只。對照組小鼠每只分別腹腔注射滅菌生理鹽水，0.2 mL/只。每日觀察并記錄小鼠臨床癥狀及死亡情況。對感染組死亡的小鼠和對照組小鼠分別采集腸系膜淋巴結(jié)、脾臟和肝臟固定于10%的福爾馬林溶液中。

1.3試驗(yàn)方法 固定的組織運(yùn)用常規(guī)病理學(xué)技術(shù)制作石蠟切片，采用蘇木素與伊紅對比染色法(Hematoxylin-Eosin staining，H&E)觀察小鼠各器官和貓回腸的病理損傷及弓形蟲發(fā)育中各階段的蟲體形態(tài)。對小鼠腸系膜淋巴結(jié)及貓回腸運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法(Immunohistochemistry，IHC)染色，觀察弓形蟲蟲體的分布。

2 結(jié) 果

2.1貓和小鼠感染弓形蟲的臨床癥狀 0～10 DPI，感染TgCatCHn4株弓形蟲的貓，未見明顯異常的臨床表現(xiàn)。每日檢查貓糞便中的卵囊發(fā)現(xiàn)，3 DPI，糞便出現(xiàn)弓形蟲卵囊；之后卵囊數(shù)量逐漸增多，6～9 DPI，卵囊數(shù)量均較多；10 DPI，摘取新鮮的貓回腸組織。

每日觀察感染弓形蟲RH株小鼠的精神狀況、食欲、飲水和被毛等臨床癥狀。3～4 DPI，小鼠精神沉郁、喜臥，采食和飲水量下降。6～9 DPI，小鼠無采食，弓背，呼吸急促、被毛逆立，100%小鼠死亡，摘取實(shí)驗(yàn)組死亡小鼠和對照組小鼠(9DPI)的腸系膜淋巴結(jié)、脾臟和肝臟。

2.2感染弓形蟲貓回腸的病理學(xué)變化及蟲體形態(tài)

眼觀，貓感染TgCatCHn4株弓形蟲包囊后，回腸未見明顯異常變化。

顯微鏡下，貓糞便可見大量未孢子化的弓形蟲卵囊，大小約11 μm×13 μm(圖1A)?；啬c黏膜涂片可見腸道上皮細(xì)胞、細(xì)長的弓形蟲裂殖子(6.1 μm×1.5 μm)和未孢子化的弓形蟲卵囊(圖1B)。病理組織學(xué)檢查可見回腸腸絨毛頂端凸凹不平，少量吸收上皮細(xì)胞脫落，絨毛頂端固有層細(xì)胞稀疏，未見明顯炎癥反應(yīng)，細(xì)胞浸潤和局部血液循環(huán)障礙?；啬c固有層可見大量弓形蟲抗體反應(yīng)陽性抗原(圖1C)，腸絨毛游離端的吸收上皮細(xì)胞內(nèi)可見大量弓形蟲裂殖體和大配子(也稱雌配子)(圖1 D)。

在回腸的腸絨毛中可觀察到密集分布的弓形蟲，其中包括無性生殖階段的裂殖體和有性生殖階段的配殖體。緩殖子黏附并入侵到腸上皮細(xì)胞中，形成含有多個裂殖子的裂殖體，裂殖體破裂后，裂殖子散出可以入侵其它的腸上皮細(xì)胞而進(jìn)行反復(fù)裂殖生殖。部分裂殖子侵入上皮細(xì)胞發(fā)育成配子體，成熟后大配子與小配子接觸受精形成合子進(jìn)而發(fā)育為卵囊，感染的腸道上皮細(xì)胞破裂并釋放出尚未孢子化的卵囊隨糞便排出體外，排出后可以在腸絨毛中觀察到排出卵囊后剩下的空泡樣結(jié)構(gòu)。

本研究中觀察到弓形蟲在回腸絨毛中各增殖階段的蟲體，主要分布于腸吸收細(xì)胞的細(xì)胞核和刷狀緣之間，也有一部分蟲體位于固有層，蟲體周圍可見透亮的納蟲泡結(jié)構(gòu)(圖1D～G)。A型裂殖體，以單個裂殖子分布于固有層，橫斷面直徑約2.1 μm(圖1D)；B型裂殖體，多位于吸收細(xì)胞細(xì)胞漿的納蟲泡或固有層淋巴細(xì)胞內(nèi)，大小約26 μm×17 μm，裂殖子呈簇狀分布(n=4)，大小約5.8 μm×2.9 μm，吸收細(xì)胞細(xì)胞核因受蟲體擠壓而變形(圖1D)；C型裂殖體，多位于吸收細(xì)胞細(xì)胞或上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，大小約16 μm×10 μm，裂殖子因以出芽方式生長常以圓環(huán)狀分布(n=18)(圖1F)；D型裂殖體，多位于吸收細(xì)胞或上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，大小約7.3 μm×5.6 μm，可見殘余體，裂殖子以花瓣?duì)罹o密排列(n=16)(圖1E)；E型裂殖體，大小約12 μm×8.8 μm，殘余體消失，裂殖子以蜂窩狀松散分布(圖1E)。配子體較大，大小約20 μm×15 μm，位于吸收細(xì)胞內(nèi)，含中央核仁和核仁周圍的大量嗜堿性物質(zhì)(圖1G)。小配子(也稱雄配子)由小配子體發(fā)育而來，較裂殖子小，雄配子大小約4.0 μm×0.7 μm(n=16)，圍繞中央殘?bào)w形成雄配子體，組織學(xué)切片未見雄配子尾部的鞭毛(圖1H)。大配子由大配子體發(fā)育而成，大小約10.0 μm×4.2 μm，含中央核仁和大量的嗜酸性的極線，與雄配子受精形成合子進(jìn)而發(fā)育為卵囊。卵囊呈橢圓形，嗜酸性，著色較淡，大小約7 μm×8 μm(圖1-I、J)。

2.3 感染弓形蟲小鼠的病理學(xué)變化及蟲體分布

眼觀，感染弓形蟲RH株急性死亡的小鼠腸系膜淋巴結(jié)形象明顯，高度腫大，質(zhì)地軟，顏色乳白色；肺臟腫大、淤血，顏色暗紅；脾臟高度腫大，顏色暗紅，質(zhì)脆；肝臟淤血，腫大，質(zhì)脆；腎上腺明顯腫大，顏色灰白色。

顯微鏡下，圖2腸系膜淋巴結(jié)和脾臟的損傷較為嚴(yán)重，表現(xiàn)為實(shí)質(zhì)細(xì)胞的大量壞死。弓形蟲侵入肝臟，形成多處局灶性壞死灶。肝細(xì)胞發(fā)生顆粒變性或水泡變性，肝細(xì)胞腫大，細(xì)胞索排列紊亂，竇狀隙變窄。弓形蟲位于肝細(xì)胞內(nèi)，并在其中繁殖，肝細(xì)胞核靠邊、變形，有的導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹、破裂、壞死。被寄生的肝細(xì)胞可見納蟲泡及多個速殖子(1～10個)的斷面，多個斷面聚集一組，呈簇狀分布于納蟲泡內(nèi)。速殖子嗜酸性，呈深紅色，斷面呈圓形或橄欖球形，略小于紅細(xì)胞，大小約2 μm×4 μm，速殖子周圍可見呈圓形的納蟲泡，納蟲泡區(qū)域H&E染色下未著色。弓形蟲引起的壞死區(qū)域常見蛋白樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。中央靜脈及匯管區(qū)小葉間靜脈周圍可見速殖子。

A：脾臟壞死灶內(nèi)分布大量弓形蟲速殖子，多個速殖子聚集呈簇狀或花瓣?duì)钆帕?箭頭)，HE染色；B：肝臟局部分布多量弓形蟲蟲體(箭頭)，HE染色；C：腸系膜淋巴結(jié)壞死，分布多量弓形蟲速殖子(箭頭)，HE染色；D：腸系膜淋巴結(jié)的弓形蟲(箭頭)，IHC染色。標(biāo)尺=50 μm。圖2 BALB/c小鼠感染RH株弓形蟲后肝臟、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)的病理變化及速殖子的分布Fig.2 Pathological lesions and the distribution of T. gondii tachyzoites in liver, spleen and mesenteric lymph nodes of BALB/c mice

脾臟被膜下可見含大量弓形蟲速殖子的巨噬細(xì)胞；白髓局灶性壞死，壞死中心可見分布成組的速殖子，速殖子排列呈簇狀或花瓣?duì)睿恍×簤乃?、溶解，紅髓淡染，分布多量速殖子。紅髓巨噬細(xì)胞內(nèi)有大量呈蜂窩狀、花瓣?duì)罘植嫉乃僦匙樱瑪?shù)量約10～20個。少量單個的速殖子分布于細(xì)胞外。網(wǎng)狀細(xì)胞增生，未見其他炎性細(xì)胞浸潤。

腸系膜淋巴結(jié)可見多處局限性壞死灶，壞死灶內(nèi)淋巴細(xì)胞大量壞死，細(xì)胞間分布多量水腫液，有的部位只殘留網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。壞死灶內(nèi)可見大量的速殖子分布，呈花瓣?duì)罨驁A環(huán)狀，數(shù)量約4～15個。嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞浸潤。IHC染色可見，弓形蟲聚集成團(tuán)分布于細(xì)胞內(nèi)，單個弓形蟲多分布于細(xì)胞間。

3 討 論

弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，幾乎能寄生在所有有核細(xì)胞中[1]。弓形蟲病之所以能廣泛流行主要依賴于：廣泛的宿主譜，終末宿主單次感染弓形蟲包囊可排泄數(shù)百個對環(huán)境有抵抗能力的弓形蟲卵囊[4]。攝入未充分煮熟的含弓形蟲包囊的肉類，食入被弓形蟲卵囊污染的蔬菜、水果和水以及經(jīng)胎盤垂直傳播是人和動物感染弓形蟲的主要途徑[1]。認(rèn)識和了解弓形蟲緩殖子在貓腸道內(nèi)的分裂生殖和卵囊的形成過程，有利于預(yù)防弓形蟲病和切斷弓形蟲的傳播途徑。

我國尚無有關(guān)對貓腸道弓形蟲無性生殖和有性生殖的蟲體形態(tài)學(xué)和蟲體分布位置的研究報(bào)道，有報(bào)道PRU蟲株緩殖子可感染體外培養(yǎng)的貓腸上皮細(xì)胞，但未見到弓形蟲的有性生殖階段[9]。本試驗(yàn)選用TgCatCHn4(Chinese1)株弓形蟲組織包囊感染貓，觀察到的弓形蟲裂殖體、裂殖子、雌雄配子和卵囊的大小和形態(tài)，與Dubey報(bào)道一致[1, 10]。Dubey研究發(fā)現(xiàn)貓感染有缺陷的T-263弓形蟲蟲株包囊，其可在貓腸道內(nèi)進(jìn)行無性裂殖生殖，并形成雌雄配子，但不能形成卵囊，可望成為貓弓形蟲疫苗的候選蟲株[10]。弓形蟲緩殖子進(jìn)入中間宿主只能分化為速殖子，然而進(jìn)入終末宿主確可分化為裂殖子、緩殖子和速殖子，其產(chǎn)生分化差異的機(jī)制尚不清晰。研究發(fā)現(xiàn)分裂過程的裂殖子表達(dá)的表面蛋白(Surface proteins, SRS)與速殖子不同，可能與裂殖子適應(yīng)腸道微環(huán)境和后期有性生殖有關(guān)[11]。本課題在以往研究弓形蟲卵囊排出過程發(fā)現(xiàn)，感染后21 d，貓回腸上皮恢復(fù)正常形態(tài)，少見裂殖子和卵囊，推測裂殖子的增殖并非持續(xù)性的。

不同基因型的弓形蟲蟲株有著不同的毒力，表現(xiàn)為對不同的宿主的致病性差異[1]。強(qiáng)毒株弓形蟲感染常引起小鼠在急性感染期死亡，尚未形成組織包囊，而弱毒株感染的小鼠多無臨床癥狀，多可進(jìn)入慢性期感染期，形成組織包囊。體內(nèi)和體外的致病性研究發(fā)現(xiàn)，TgCatHn4是一株弱毒株，小鼠灌胃感染105個弓形蟲卵囊的生存期超過60 d，也難以檢測到組織包囊，病理損傷幾乎觀察不到[8]。而RH株弓形蟲是Ⅰ型的強(qiáng)毒株，有報(bào)道腹腔接種103個速殖子可以引起小鼠急性期死亡[12]。王莉發(fā)現(xiàn)肝臟和脾臟白髓出現(xiàn)了凝固性壞死，壞死灶及其附近有弓形蟲速殖子聚集[13]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)脾臟被膜下及紅髓分布的弓形蟲速殖子數(shù)量遠(yuǎn)多于白髓，可能與腹腔感染途徑有關(guān)。李永念觀察到肝細(xì)胞的變性、壞死和大量炎性細(xì)胞浸潤[14]，但本研究未觀察到大量炎性細(xì)胞浸潤。由于早期發(fā)表文獻(xiàn)年代久遠(yuǎn)，病理變化和蟲體形態(tài)的圖片不清，所以本研究對小鼠感染RH弓形蟲急性感染期的病理變化和蟲體形態(tài)進(jìn)行展示。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，弓形蟲感染后主要引起組織細(xì)胞壞死，壞死處分布多量速殖子，蟲體形態(tài)與Dubey報(bào)道一致[1]。

該研究填補(bǔ)了我國ToxoDB#9弓形蟲蟲株在終末宿主生殖過程的形態(tài)學(xué)研究空白，展示了小鼠感染RH株弓形蟲的主要器官病理學(xué)變化和在器官中速殖子簇狀分布的形態(tài)特點(diǎn)。清晰了解弓形蟲各增殖階段(速殖子和裂殖子，包囊和卵囊)的生物學(xué)功能、形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記，對于探討弓形蟲的致病機(jī)理，從終末宿主角度切斷弓形蟲的傳播途徑非常重要。