下調MTDH表達抑制膠質瘤U87細胞增殖、遷移與侵襲

張金燦 廖勇仕

摘要 目的：探討下調異黏蛋白（MTDH）的表達對膠質瘤細胞U87增殖、遷移和侵襲的影響。方法：使用脂質體將MTDH干擾小RNA（MTDH siRNA）轉染U87細胞（處理組），同時用si-NC轉染U87細胞作為陰性對照（對照組）。利用qRT-PCR驗證轉染后U87細胞的MTDH表達水平。通過MTT法、細胞劃痕、transwell侵襲實驗觀察下調MTDH的表達對U87細胞增殖、遷移和侵襲的影響。結果：處理組細胞的MTDH表達量明顯下調，表明轉染MTDH siRNA能有效下調U87細胞的MTDH表達。MTT實驗表明，與對照組細胞相比，處理組的細胞增殖速度明顯下降。細胞劃痕實驗顯示下調MTDH的表達抑制了細胞的遷移能力。Transwell侵襲實驗顯示，處理組的細胞侵襲能力較對照組細胞明顯下降。結論：下調MTDH的表達能抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，MTDH可成為治療膠質瘤的潛在靶點。

關鍵詞 膠質瘤;MTDH;細胞增殖;細胞侵襲

異黏蛋白（MTDH）又稱星型膠質細胞上調基因-1（AEG-1），在多種腫瘤中高表達，如乳腺癌、肝癌、結直腸癌等[1-3]。研究表明，MTDH可通過P13K/AKT，NF-κB及Wnt/β-catenin等信號通路，調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其高表達與腫瘤轉移、耐藥、血管生成、預后差相關。然而MTDH在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究通過小RNA干擾技術（siRNA）沉默內源性MTDH，下調MTDH的表達，研究下調MTDH對膠質瘤細胞U87增殖、遷移和侵襲的影響，探討MTDH在膠質瘤中生物學功能，對將MTDH發(fā)展成一個治療膠質瘤的新靶標，改善膠質瘤的預后具有重要意義。

資料與方法

實驗材料：MTDH siRNA及qRT-PCR檢測試劑盒，轉染試劑脂質體2000。

細胞培養(yǎng)：膠質瘤細胞株U87購置上海細胞研究所，在5% CO₂、37℃條件下，培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640中。

細胞轉染：分為處理組（MTDHsiRNA）與對照組（si-NC），接種細胞于96孔板完全培養(yǎng)基中，細胞生長至30%～50%密度;無菌EP管配好轉染試劑及siRNA于無血清培養(yǎng)液，室溫放5min，按操作程序轉染細胞，置于37℃、5%COz培養(yǎng)箱中，6h后換液，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細胞。

qRT-PCR檢測MTDH表達水平：qRT-PCR反應：反應體系20μL，包括5μmol/L MTDH特異PCR引物0.4μL、稀釋后的RT產物2μL、5U/μL耐熱DNA聚合酶0.2μL、2×qRT-PCR緩沖液10μL、滅菌雙蒸水7.4μL。反應條件：95℃3min活化Tag酶，然后95℃12s、62℃35s，共40個循環(huán)。

MTT法檢測細胞增殖活性：MTDH處理U87細胞24h，0.25%胰酶消化，吹打成單細胞懸液離心。用含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成5×10⁴個/mL細胞懸液，取200μL接種于96孔板中，設復孔5個。置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱48h。每孔加滅菌MTT液（5mg/mL）20μL。選擇570nm波長，酶標儀檢測各孔吸光值并記錄。實驗重復3次。

細胞劃痕和transwell侵襲實驗檢測細胞遷移和侵襲能力：MTDH轉染U87細胞48h后，消化細胞，用無血清培基洗滌2次，按操作進行。

統(tǒng)計學處理：采用SPSS19.0分析數據，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗;計數資料用（%）表示，采用χ²檢驗。P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

結果

下調MTDH后U87細胞增殖速度下降：與對照組細胞（1.00±0.06）相比，轉染MTDH siRNA后處理組細胞MTDH的表達量（0.28±0.01）明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明MTDH siRNA能有效下調U87細胞的MTDH表達。然后，我們通過MTT法檢測下調MTDH對U87細胞增殖的影響。結果顯示，轉染MTDH48h后，與對照組細胞（0.564±0.01）相比，處理組細胞的增殖速度（0.234±0.02）明顯減慢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

下調MTDH后U87細胞遷移能力下降：與對照組細胞（0.57±0.02）相比，細胞劃痕48h后處理組細胞劃痕愈合率（0.25±0.03）明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示下調MTDH表達能夠在一定程度上抑制U87細胞遷移。

下調MTDH后U87細胞侵襲能力下降：我們將細胞接種于Transwells小室，置于24孔板，48h后取出Transwells小室固定，結晶紫染色，顯微鏡下計數5個視野穿出的細胞數。統(tǒng)計分析發(fā)現，與對照組細胞（253.2±12.30）相比，處理組細胞的侵襲能力（108.6±9.29）明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示下調MTDH表達明顯抑制U87細胞的侵襲能力。

討論

膠質瘤是目前臨床中較為常見的一種中樞神經系統(tǒng)腫瘤，其臨床治療效果差，容易復發(fā)，對患者的健康和生活產生嚴重的影響。在目前的醫(yī)療技術手段下，針對膠質瘤患者，主要采用手術治療，然后結合放療和化療進行治療，但治療效果欠佳，并且無論手術治療還是放化療，均會對患者的身體產生較大的損害，給患者身體和精神上造成嚴重的打擊，嚴重降低患者的生活質量，也給患者家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。隨著對膠質瘤發(fā)生和發(fā)展過程研究的深人，其具體的發(fā)病機制方面已取得了重大的突破，但針對其治療，尚沒有研究出更好的手段，其治療效果和預后無較大的改善，尤其在一些惡性程度較高的膠質瘤患者中，預后極差[4]。

目前基因診斷和基因治療是研究的熱點，許多學者在該領域開展了大量的研究，目前研究的主要思路是尋找一個明確的作用靶點，然后通過作用于該靶點來阻斷基因的表達，從而影響到其后的信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖，并促進其逐漸凋亡。目前臨床中已發(fā)現多個作用靶點，而其中最為重要的一個就是MTDH，其已被證實在多種腫瘤中表達升高，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉移及耐藥相關，是腫瘤診斷、治療及預后評價的一個重要靶點。研究發(fā)現，干擾MTDH表達可抑制食管癌細胞增殖，使細胞周期阻滯在S期[5]。下調MTDH基因表達，還可以抑制乳腺癌細胞上皮間質轉化，降低其侵襲和遷移能力[6]。表明MTDH抑制劑不僅可以抑制腫瘤生長，而且還能降低腫瘤轉移的風險，具有成為腫瘤新療法的前景。但MTDH在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚需進一步研究。

有研究者報道m(xù)iR-22可通過靶向抑制MTDH的表達從而抑制膠質瘤細胞的增殖[7]。本研究通過在膠質瘤細胞U87中轉染MTDH siRNA，觀察下調MTDH表達對U87細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。MTT試驗結果表明下調MTDH能明顯抑制膠質瘤細胞的增殖能力。我們的試驗結果表明下調MTDH能抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力，MTDH可能成為治療膠質瘤的潛在靶點。

但MTDH的功能特性及治療潛能還有待進一步研究確認。在將來的研究中，我們仍會重點傾向于研究MTDH在膠質瘤中的功能和機制，使該領域的研究更加深入，并逐步探討其在膠質瘤治療中的應用前景，為膠質瘤的防治提供依據。

參考文獻

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[7]李榮國，王劍，楊少陵.miR-22通過靶向MTDH抑制膠質瘤細胞的生長[J].中國癌癥雜志，2014，2（6）：401.