短時受精聯(lián)合R-ICSI、half-ICSI、過夜受精在不同不孕情況中的應(yīng)用

史鴻志，張楠，秦妍，李偉偉，李麗瑋

(秦皇島市婦幼保健院，秦皇島 066000)

在常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過程中仍然有10%～25%發(fā)生低受精或完全受精失敗的風(fēng)險[1]，這種情況一旦發(fā)生，將會給醫(yī)生和患者帶來沉重的打擊。其原因是多方面的，具體機(jī)制尚不清楚。目前用于預(yù)防IVF受精失敗發(fā)生的方法，主要是部分卵胞漿內(nèi)單精子注射(half-ICSI)[2]和短時受精聯(lián)合早期補(bǔ)救ICSI(R-ICSI)[3]。而在IVF的受精方式中，短時受精、過夜受精、half-ICSI受精的選擇還存在爭議。為了盡量降低初次IVF助孕周期受精失敗(包括完全受精失敗和受精率<30%，以下總稱受精失敗)的發(fā)生，同時盡可能根據(jù)患者的不同情況選擇對患者更有利的受精方式，我中心根據(jù)患者原發(fā)及繼發(fā)不孕類型的不同，制定了個體化的受精方案，并對臨床結(jié)局進(jìn)行比較分析，以期更好地指導(dǎo)臨床工作。

資料和方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2016年1月至2017年12月在我院行首次IVF助孕的周期的臨床資料，共計466個周期。除外獲卵數(shù)<4枚、卵母細(xì)胞成熟障礙者。所有患者在醫(yī)師充分告知后簽署知情同意書。

將納入對象按照不孕類型的不同進(jìn)行區(qū)分，原發(fā)不孕和繼發(fā)不孕無生育史的患者分為2組，分別行短時受精聯(lián)合早期R-ICSI(A組，n=123)和half-ICSI(B組，n=45)；對單純繼發(fā)不孕患者也分為2組，分別采用短時受精聯(lián)合早期R-ICSI(C組，n=94)和過夜受精(D組，n=204)。分別比較各組患者的一般資料、受精情況、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局。

二、研究方法

1.促排卵和取卵：為了減少促排卵方案帶來的差異，選擇長方案、拮抗劑方案的病例進(jìn)行統(tǒng)計分析。促排卵藥物有注射用重組人卵泡刺激素(果納芬，默克，瑞士，75 U/支)，當(dāng)1個主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm或2個≥17 mm或3個≥16 mm時，皮下注射重組人絨毛膜促性腺激素(HCG，艾澤，默克，瑞士，250 μg/支)，36 h取卵。

2.精液收集及處理：男方禁欲2～7 d，手淫法獲取精液。采用密度梯度離心法結(jié)合上游法處理精液，處理方法如下：將1 ml 80%的高濃度梯度液加入15 ml尖底離心管的底部，在上面輕輕加入1 ml 40%低濃度梯度液，在最上層輕輕加入液化后的精液，100g離心20 min；去上層液體，將沉淀轉(zhuǎn)移至含3 ml受精培養(yǎng)液的新離心管里充分混勻，300g離心5 min；去上清將沉淀混勻后加入圓底離心管的底部上游備用，圓底離心管的上游液體量視回收沉淀的多少調(diào)節(jié)，一般采用0.5 ml受精液作為上游液，放入6%的CO2培養(yǎng)箱中孵育。

3.不同授精方式及培養(yǎng)：(1)A組：HCG后39～40 h將卵-冠-丘復(fù)合體與精子混合，授精后5 h去除顆粒細(xì)胞，并置于新培養(yǎng)皿中觀察第二極體，若出現(xiàn)第二極體的卵母細(xì)胞占成熟卵母細(xì)胞比率(2PB率)<30%，記為低受精周期，并于1 h后再次觀察，確認(rèn)第二極體排出的卵母細(xì)胞比率沒有明顯變化后，對明確1個極體的卵母細(xì)胞行R-ICSI。(2)B組：將患者的卵母細(xì)胞分為2組，分別采用常規(guī)IVF和ICSI方法授精。IVF授精：HCG后39～40 h將卵-冠-丘復(fù)合體與精子混合，培養(yǎng)過夜后去除顆粒細(xì)胞，觀察卵母細(xì)胞受精情況。ICSI授精：HCG后39～41 h行ICSI授精。(3)C組：方法與A組相同。D組：HCG后39～40 h將卵-冠-丘復(fù)合體與精子混合，采用中央井皿混合受精，培養(yǎng)過夜后去除顆粒細(xì)胞，觀察卵母細(xì)胞受精情況。

4.體外培養(yǎng)及胚胎發(fā)育評級：授精后18～20 h觀察原核，出現(xiàn)雙原核(2PN)記為正常受精，繼續(xù)體外培養(yǎng)至取卵后第3天對胚胎進(jìn)行質(zhì)量評估：根據(jù)胚胎卵裂球數(shù)目、形態(tài)、大小是否均勻及有無碎片等將胚胎分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級，其中7～9細(xì)胞的Ⅰ、Ⅱ級胚胎評為優(yōu)質(zhì)胚胎。

5.胚胎移植：取卵后第3天，選擇相對優(yōu)質(zhì)胚胎(R-ICSI及half-ICSI周期優(yōu)先選擇IVF受精胚胎)進(jìn)行移植。經(jīng)患者充分知情同意后，新鮮移植患者剩余可用胚胎較多時，可適當(dāng)冷凍2～4枚卵裂期胚胎，全胚冷凍患者一般冷凍4枚相對優(yōu)質(zhì)胚胎，對其余胚胎行囊胚培養(yǎng)。將胚胎繼續(xù)體外培養(yǎng)至第5～6天，對于形成的可用囊胚進(jìn)行冷凍。

6.黃體支持及妊娠結(jié)局判斷：胚胎移植后予肌內(nèi)注射黃體酮注射液(浙江仙琚)60 mg/d或陰道內(nèi)塞黃體酮陰道緩釋凝膠(雪諾同，默克，瑞士，90 mg/支)90 mg/d，同時聯(lián)合口服黃體酮軟膠囊(浙江仙琚)100 mg/次、2次/d支持黃體功能。移植后14 d檢測血HCG水平，陽性為生化妊娠；移植后35 d超聲監(jiān)測到宮內(nèi)妊娠囊為臨床妊娠。

7.觀察指標(biāo)：由于R-ICSI和half-ICSI周期同時存在IVF和ICSI的卵母細(xì)胞，為了便于統(tǒng)計計算，全部采用成熟卵母細(xì)胞作為分母。2PN率=2PN卵母細(xì)胞數(shù)/成熟卵母細(xì)胞數(shù)；2PN卵裂率=2PN卵裂數(shù)/2PN卵母細(xì)胞數(shù)；多PN率=多PN卵母細(xì)胞數(shù)/成熟卵母細(xì)胞數(shù)；ICSI卵母細(xì)胞率=ICSI助孕卵母細(xì)胞總數(shù)/成熟卵母細(xì)胞總數(shù)；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)；囊胚形成率=囊胚數(shù)/養(yǎng)囊胚胎數(shù)；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)；胚胎種植率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計量資料用(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組一般情況比較

A組和B組的女方年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、體重指數(shù)(BMI)、內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、男方精子濃度、前向運(yùn)動精子百分率等比較，均無顯著性差異(P>0.05)，但B組的獲卵數(shù)顯著高于A組(P<0.05)；C組和D組的各項(xiàng)指標(biāo)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、各組受精情況、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局比較

A組低受精率、完全受精失敗率及總受精失敗率均顯著高于B組(P<0.05)，ICSI卵母細(xì)胞率顯著低于B組(P<0.05)；A、B兩組的MⅡ卵受精率、2PN率比較無顯著性差異(P>0.05)。C組的正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率略低于D組，多PN率略高于D組，但尚無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、A組中原發(fā)不孕和繼發(fā)不孕無生育史患者的受精失敗率比較

原發(fā)不孕和繼發(fā)不孕無生育史兩個亞組間比較，完全受精失敗率、低受精率和總受精失敗率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表1 各組一般情況比較 (x-±s)

注：與A組比較，*P<0.05

表2 各組受精情況、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局比較 (%)

注：與B組比較，*P<0.05；a只計算IVF授精部分卵母細(xì)胞的多PN率

表3 A組中原發(fā)不孕和繼發(fā)不孕無生育史患者受精失敗率比較 [(x-±s)，%]

討 論

原發(fā)不孕、男方精液臨界水平一般認(rèn)為是受精失敗的高危因素[4-5]。在選擇受精方式時，除原發(fā)不孕外，我們將繼發(fā)不孕無生育史也列為高危因素，對這部分病人行短時受精聯(lián)合早期R-ICSI，對于獲卵數(shù)大于12枚的部分周期行half-ICSI，而對于單純繼發(fā)不孕患者行過夜受精。我們的研究中，A組總的受精失敗率顯著高于B組(P<0.05)。短時受精聯(lián)合R-ICSI避免了如此高比例的受精失敗的發(fā)生，由此可見，對原發(fā)不孕及繼發(fā)不孕無生育史的患者實(shí)施短時受精聯(lián)合R-ICSI預(yù)防受精失敗發(fā)生的作用是明顯的，與劉蘭蘭等[6]學(xué)者的研究一致。同時我們比較了短時受精聯(lián)合R-ICSI組中原發(fā)不孕和繼發(fā)不孕無生育史的患者兩組間受精失敗的發(fā)生率(表3)，發(fā)現(xiàn)兩組間受精失敗的發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異，可見在我們的研究中繼發(fā)不孕無生育史的不孕患者也是受精失敗發(fā)生的高危人群，這類患者對A組中受精失敗的發(fā)生沒有產(chǎn)生影響。

與劉苡萱等[7]、朱琴等[8]的研究不盡相同，我們發(fā)現(xiàn)原發(fā)不孕和繼發(fā)不孕無生育史的患者中half-ICSI預(yù)防初次IVF助孕周期受精失敗發(fā)生的作用并不明顯，受精失敗的發(fā)生率較低，45個周期只發(fā)生1例IVF完全受精失敗，無低受精的發(fā)生。但half-ICSI增加了過度ICSI的風(fēng)險，ICSI卵母細(xì)胞率遠(yuǎn)高于短時受精聯(lián)合R-ICSI組(50.89% vs.16.02%，P<0.05)，兩組間受精率、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局方面比較則沒有顯著性差異。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因我們考慮可能與half-ICSI的周期普遍取卵較多，卵巢功能較好，取到的卵母細(xì)胞質(zhì)量較好有關(guān)。然而half-ICSI組中樣本數(shù)較少，具有一定的局限性，且由于是回顧性研究，研究結(jié)果可能存在偏倚，后續(xù)還需要大數(shù)據(jù)的支持論證。此外，有學(xué)者回顧性分析half-ICSI中常規(guī)IVF完全受精失敗的周期與短時IVF聯(lián)合R-ICSI兩種授精方式的助孕結(jié)局，發(fā)現(xiàn)兩組ICSI部分受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義[9]，提示half-ICSI中IVF卵母細(xì)胞受精失敗與R-ICSI相比降低了卵母細(xì)胞利用率。因此，建議在初次IVF助孕周期選擇half-ICSI時需要慎重考慮，或者直接采用短時聯(lián)合R-ICSI更為合適，這與劉琨等[10]的研究一致。

單純繼發(fā)不孕患者短時受精和過夜受精兩種授精方式在受精情況、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局上沒有顯著性差異。兩種受精方式發(fā)生受精失敗的比率很低，短時受精聯(lián)合R-ICSI組94個周期發(fā)生2例受精失敗，受精失敗率2.13%；過夜受精組204周期無1例完全受精失敗發(fā)生，低受精發(fā)生4例，受精失敗率1.96%，組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。值得注意的是，過夜受精組沒有因?yàn)樵黾泳优c卵母細(xì)胞的作用時間導(dǎo)致細(xì)胞代謝產(chǎn)物及過氧化物增加，而對胚胎后續(xù)發(fā)育產(chǎn)生明顯影響[11-12]，反而在2PN受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、多PN受精率等指標(biāo)上有優(yōu)于短時受精聯(lián)合R-ICSI組的趨勢，但尚無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，與之前一些研究報道[13-14]相似。其可能因?yàn)檫^夜受精減少了體外操作和暴露時間，一些卵母細(xì)胞在過夜培養(yǎng)過程中胞質(zhì)和細(xì)胞核達(dá)到了更好的成熟狀態(tài)，且在一個合適的受精濃度范圍內(nèi)，精卵作用時間的延長并不產(chǎn)生負(fù)面的影響，反而為卵母細(xì)胞提供了更多的優(yōu)質(zhì)精子選擇。因此對單純繼發(fā)不孕的患者首次行IVF助孕時，在患者充分知情同意并理解的前提下，采用過夜受精仍是值得肯定的方法之一。

本研究中，466個周期總受精失敗周期為27個，發(fā)生率為5.79%，略低于之前學(xué)者報道的10%～25%[1]，與Liu等[15]研究相近，可能是因?yàn)槲覀兘y(tǒng)計時去掉了獲卵數(shù)少于4個和卵母細(xì)胞發(fā)育障礙的周期，而這些周期是受精失敗的高發(fā)周期。由此可見，IVF過程中，發(fā)生受精失敗的比率還是較高的，如何權(quán)衡預(yù)防受精失敗和獲得更好的受精結(jié)局就需要生殖醫(yī)學(xué)科的醫(yī)生綜合評估后做出有利決定。

綜上所述，對于原發(fā)不孕及繼發(fā)不孕無生育史的患者，短時IVF聯(lián)合R-ICSI能很好地預(yù)防受精失敗的發(fā)生，提高了本周期卵母細(xì)胞的利用率。對于單純繼發(fā)不孕患者，過夜受精的結(jié)局似乎比短時受精更有優(yōu)勢，仍然是值得肯定的授精方式之一。生殖醫(yī)生應(yīng)在盡可能避免受精失敗的同時，使患者獲得更好的妊娠結(jié)局，實(shí)行個體化的受精方式也正是基于此點(diǎn)考慮。