夾尾刺激對(duì)大鼠背外側(cè)前額葉和杏仁核神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩的影響

張忠楠，王美美，江 楠，孫睿琦，王邦安，汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.細(xì)胞電生理研究室；2.啟明星小組，安徽 蕪湖 241002)

神經(jīng)振蕩是大腦內(nèi)有節(jié)律的放電現(xiàn)象，各腦區(qū)間的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩在大腦執(zhí)行高級(jí)功能時(shí)起重要作用[1]，且神經(jīng)振蕩可以調(diào)節(jié)腦區(qū)間的信息交流強(qiáng)度[2]。背外側(cè)前額葉(dorsolateral prefrontal cortex,DLPFC)和杏仁核(amygdala)[3]是情緒調(diào)節(jié)的重要核團(tuán)，兩核團(tuán)的神經(jīng)振蕩在情緒調(diào)控中的作用還未見相關(guān)報(bào)道。因此，我們參照腦內(nèi)雙核團(tuán)和外周生理指標(biāo)同步記錄技術(shù)[4]，記錄夾尾刺激前后DLPFC亞區(qū)島葉無(wú)顆粒皮質(zhì)背部(agranular insular area,AID)[5]和杏仁核亞核基底外側(cè)杏仁核(basolateral amygdala,BLA)的細(xì)胞外電活動(dòng)，以及心電、呼吸肌肌電，觀察和比較夾尾刺激前后核團(tuán)神經(jīng)振蕩的特征和外周生理指標(biāo)的變化，為進(jìn)一步研究傷害性刺激引起的負(fù)性情緒變化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量260～350 g，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。

1.2 儀器和藥品 腦立體定位儀(瑞沃德68000系列)、保溫毯系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)、電生理屏蔽罩、防震臺(tái)、PowerLab 八通道生理信號(hào)采集系統(tǒng)及其 Chart Pro 分析軟件 (AD Instruments，Australia)、生物電放大器(美國(guó) A-M Systems，MODEL 1800)、玻璃微電極和金屬參考電極、20%烏拉坦、3%雙氧水等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物麻醉 用20%烏拉坦麻醉大鼠(1.5 g/kg,ip)，直至夾捏刺激無(wú)明顯反應(yīng)。麻醉穩(wěn)定后，將大鼠俯臥位固定于電生理屏蔽罩內(nèi)的防震臺(tái)上的腦立體定位儀上，下面墊保溫毯，溫度設(shè)置為37 ℃。

1.3.2 外周生理指標(biāo)記錄[4]大鼠右前肢腕關(guān)節(jié)、左后肢踝關(guān)節(jié)上部的皮下分別插入針式電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，右后肢針式電極接地。將兩根針式電極插入大鼠右側(cè)腋中線第9肋下緣肋間外肌，記錄呼吸肌肌電圖。

1.3.3 腦內(nèi)雙核團(tuán)細(xì)胞外記錄[4]使大鼠咬合門齒桿并插入耳桿呈左右對(duì)稱，固定大鼠頭部使之不能移動(dòng)，用手術(shù)刀切開頭皮，3%雙氧水反復(fù)擦拭直至暴露顱骨前囟、人字縫，調(diào)節(jié)前囟和人字縫至同一水平面。定位：BLA為前囟后1.56 ～3.36 mm,右旁開3.90 ～ 4.60 mm,硬腦膜表面以下7.80 ～ 8.82 mm；AID為前囟前2.52 ～ 4.20 mm，右旁開2.40 ～ 4.20 mm，硬腦膜表面以下4.40 ～ 5.40 mm[6]。用牙科鉆鉆顱開窗，以冷光源照明，用彎針頭挑破硬腦膜、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜，玻璃電極(內(nèi)充電極液)在操作臂的牽引下緊貼腦組織，安置好參考電極及接地電極，記錄電極接入記錄放大系統(tǒng)并下至目標(biāo)腦區(qū)后尋找合適、明確的細(xì)胞外放電信號(hào)，待AID、BLA及各項(xiàng)外周生理指標(biāo)信號(hào)穩(wěn)定后，記錄基礎(chǔ)數(shù)據(jù)20 min并存盤。

1.3.4 傷害性刺激[7]使用充分絕緣的血管鉗夾持大鼠尾巴中末1/3處，以后肢抽動(dòng)為宜，5 s后撤離刺激，持續(xù)觀察并記錄刺激前20 min和刺激后40 min的各項(xiàng)信號(hào)。

1.3.5 信號(hào)采集參數(shù)設(shè)置[7-8]各項(xiàng)信號(hào)由Chart 5軟件進(jìn)行采集、存盤，采樣頻率4 kHz，心電為低通200 Hz、高通10 Hz，呼吸肌肌電為低通200 Hz、高通0.1 Hz，AID和BLA 為高通1 Hz、低通5000 Hz。

1.3.6 記錄位點(diǎn)鑒定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大鼠斷頭取腦于4%甲醛溶液內(nèi)固定后，進(jìn)行冠狀面切片，觀察滂胺天藍(lán)標(biāo)記位置，以鑒定記錄位點(diǎn)。僅將記錄位點(diǎn)正確的樣本納入結(jié)果的統(tǒng)計(jì)和分析。

1.4 記錄信號(hào)分析

1.4.1 放電頻率和神經(jīng)振蕩分析 對(duì)核團(tuán)電信號(hào)高通80 Hz數(shù)字濾波[8]以分析放電頻率。對(duì)核團(tuán)放電原始數(shù)據(jù)帶寬濾波得各神經(jīng)振蕩信號(hào)：delta(1～4 Hz)，theta(4～10 Hz)，beta(10～30 Hz),gamma(30～80 Hz)，fast(80～200 Hz)[1]，用FFT功能分析各神經(jīng)振蕩的能量。將各神經(jīng)振蕩信號(hào)另存為TXT格式文件，將兩核團(tuán)相同神經(jīng)振蕩的數(shù)據(jù)(TXT文件)導(dǎo)入MATLAB R2010b軟件里，用Hilbert功能提取數(shù)據(jù)的相位信息，按照計(jì)算相位鎖值(PLV)的公式進(jìn)行編程[9]和分析。

1.4.2 外周生理指標(biāo)分析[7]使用直接計(jì)數(shù)法對(duì)呼吸頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用記錄一段時(shí)間內(nèi)心率的平均值代表心率值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，刺激前后數(shù)據(jù)比較用配對(duì)t檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦內(nèi)雙核團(tuán)細(xì)胞外電活動(dòng)和外周生理指標(biāo)同步記錄 對(duì)AID和BLA細(xì)胞外電活動(dòng)、呼吸肌肌電(EMG)、心電(ECG)的同步記錄(圖1)，經(jīng)高通80 Hz濾波可得到單位放電記錄(圖2)，而分波段進(jìn)行帶寬濾波則得到各神經(jīng)振蕩記錄(圖3)。

從上往下依次為右側(cè)島葉無(wú)顆粒皮質(zhì)背部 (R-AID,μV)、基底外側(cè)杏仁核 (R-BLA,μV)電信號(hào)，心電(ECG,μV)，呼吸肌肌電(EMG,μV)。

圖1 大鼠雙核團(tuán)細(xì)胞外電活動(dòng)和外周生理指標(biāo)同步記錄

從上往下依次為右側(cè)AID、BLA的單位放電(μV)。

圖2 大鼠雙核團(tuán)單位放電記錄

從上到下依次為delta、theta、beta、gamma、fast神經(jīng)振蕩(μV)。

圖3 大鼠雙核團(tuán)神經(jīng)振蕩記錄

2.2 夾尾刺激對(duì)大鼠AID、BLA放電活動(dòng)的影響

2.2.1 放電頻率變化 夾尾刺激對(duì)大鼠雙核團(tuán)放電和外周生理指標(biāo)、雙核團(tuán)單位放電及雙核圖神經(jīng)振蕩的典型影響分例示于圖4、5、6。分析12只大鼠AID、BLA刺激前2 min、刺激時(shí)5 s、刺激后2 min放電頻率顯示，夾尾刺激顯著升高了AID和BLA的放電頻率 [AID:差值(16.62±3.31)Hz，t=5.007，P<0.001；BLA:差值(14.80±3.27)Hz，t=4.528，P<0.01],刺激后均逐漸恢復(fù)(圖7)。

2.2.2 神經(jīng)振蕩的能量變化 分析大鼠夾尾刺激前后各神經(jīng)振蕩的能量，結(jié)果刺激時(shí)兩核團(tuán)delta和theta振蕩的能量減弱(P<0.05)，gamma和fast振蕩的能量有增強(qiáng)趨勢(shì)(P>0.05)，且都在刺激后恢復(fù)(圖8)。

從上往下依次為右側(cè)AID、BLA電信號(hào)(μV)，心電(ECG,μV)，呼吸肌肌電(EMG,μV)；箭頭表示夾尾刺激的開始，持續(xù)5 s。

圖4 夾尾刺激對(duì)大鼠雙核團(tuán)細(xì)胞外電活動(dòng)和外周生理指標(biāo)的影響

從上往下依次為右側(cè)AID、BLA的單位放電(μV)；箭頭表示夾尾刺激的開始，持續(xù)5 s。

圖5 夾尾刺激對(duì)大鼠雙核團(tuán)單位放電的影響

從上到下依次為delta、theta、beta、gamma、fast神經(jīng)振蕩(μV)；箭頭表示夾尾刺激的開始，持續(xù)5 s。

圖6 夾尾刺激對(duì)大鼠雙核團(tuán)神經(jīng)振蕩的影響

上圖為AID(A)和BLA(B)的放電頻率直方圖，箭頭表示刺激的開始，持續(xù)5 s；下圖為AID(C)和BLA(D)的放電頻率統(tǒng)計(jì)圖 (n=12，配對(duì)t檢驗(yàn)：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

圖7 夾尾刺激對(duì)AID和BLA放電頻率的影響(bin=1s)

n=12，配對(duì)t檢驗(yàn)：*P<0.05。

圖8 夾尾刺激對(duì)兩核團(tuán)delta(A)、theta(B)、beta(C)、gamma(D)、fast(E)振蕩能量的影響

2.2.3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩的相位鎖值變化 計(jì)算分析大鼠夾尾刺激前后兩核團(tuán)間各神經(jīng)振蕩的相位鎖值，結(jié)果刺激后兩核團(tuán)間delta、theta、fast振蕩的相位鎖值均降低(P<0.05)，見圖9。

2.3 夾尾刺激對(duì)外周生理指標(biāo)的影響 分析大鼠夾尾刺激前后的心率、呼吸頻率，顯示刺激時(shí)心率升高(P<0.05)，且刺激后并未立即恢復(fù)，呼吸頻率升高(P<0.01)，刺激后逐漸恢復(fù)(P<0.01)，見圖10。

n=12，配對(duì)t檢驗(yàn)：*P<0.05。

圖9 夾尾刺激對(duì)AID和BLA間神經(jīng)振蕩相位鎖值的影響

n=12，配對(duì)t檢驗(yàn)：*P<0.05，**P<0.01。

圖10 夾尾刺激對(duì)呼吸頻率(A)和心率(B)的影響

3 討論

杏仁核和背外側(cè)前額葉都是負(fù)性情緒調(diào)控的關(guān)鍵腦區(qū)[3]，而夾尾刺激可引起負(fù)性情緒的變化[7]。本實(shí)驗(yàn)同步記錄和分析夾尾刺激前后正常大鼠AID、BLA的細(xì)胞外電活動(dòng)、心電和呼吸肌肌電，結(jié)果刺激升高兩核團(tuán)的放電頻率，并逐漸恢復(fù)，與之前夾尾刺激引起的變化相似[7]；刺激降低了AID、BLA低頻段(delta、theta)的能量，而高頻段(gamma、fast)的能量有增高趨勢(shì)，不同的神經(jīng)振蕩提示不同的生理狀態(tài)，一般認(rèn)為低頻成分降低和高頻成分增多反映腦電的去同步化狀態(tài)[2]，表明夾尾刺激對(duì)AID、BLA有激活作用。至于激活的具體通路，根據(jù)已有對(duì)BLA、內(nèi)側(cè)前額葉(mPFC)和DLPFC聯(lián)系的研究[3，10]，特別是有研究指出背外側(cè)前額葉對(duì)杏仁核有自上而下的抑制作用[3]等，提示夾尾刺激影響AID、BLA放電有直接或間接通路的可能性，均有待進(jìn)一步研究。另外，相位同步是相同節(jié)律的神經(jīng)振蕩在不同腦區(qū)間相互調(diào)制的表現(xiàn)，與腦區(qū)間的信息交流有密切聯(lián)系[2，9]，本實(shí)驗(yàn)中，刺激降低了AID和BLA間delta、theta振蕩的相位鎖值，說(shuō)明夾尾刺激干擾了AID和BLA間低頻段正常的信息交流。因此，夾尾刺激不僅改變了兩核團(tuán)delta和theta振蕩的能量，而且還降低了核團(tuán)間delta、theta振蕩的相位鎖值，同時(shí)結(jié)合反映情緒變化的外周生理指標(biāo)[11]，說(shuō)明delta和theta振蕩可能與傷害性刺激引起的相關(guān)負(fù)性情緒變化有聯(lián)系，但是具體的過程和機(jī)制需進(jìn)一步探索。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用腦內(nèi)雙核團(tuán)和外周生理指標(biāo)同步記錄技術(shù)[4]，記錄了背外側(cè)前額葉和杏仁核的細(xì)胞外電活動(dòng)、心電和呼吸肌肌電，作為夾尾刺激引起情緒變化的指標(biāo)，并分析兩核團(tuán)各神經(jīng)振蕩的特性，結(jié)果顯示夾尾刺激引起了大鼠兩核團(tuán)神經(jīng)振蕩以及心率和呼吸頻率的顯著變化，將負(fù)性情緒調(diào)控的關(guān)鍵核團(tuán)[3]的神經(jīng)振蕩與反應(yīng)情緒變化的外周生理指標(biāo)[11]結(jié)合分析，為進(jìn)一步研究神經(jīng)振蕩在相關(guān)負(fù)性情緒調(diào)控中的作用奠定了基礎(chǔ)。