柱前衍生-高效液相色譜法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)型飲料中γ-氨基丁酸的含量

吳 慧，崔本來

（1.商丘學(xué)院 風(fēng)景園林學(xué)院，河南 商丘 476113；2.商丘學(xué)院 體育學(xué)院，河南 商丘 476113）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種多功能分子，對(duì)人體有多種生理功能，如增進(jìn)腦活力、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、增加生長(zhǎng)激素分泌、健肝利腎等[1-3]，而運(yùn)動(dòng)型飲料中也會(huì)添加此種物質(zhì)來增加其產(chǎn)品的功效和賣點(diǎn)。運(yùn)動(dòng)型飲料是一種根據(jù)人體運(yùn)動(dòng)生理特點(diǎn)而配制的飲品，能補(bǔ)充人體運(yùn)動(dòng)后或者疲勞時(shí)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4-5]，因其是針對(duì)特殊人群飲用的一種飲品，具有一定的特殊性，對(duì)食品的安全性要求高，所以更需要對(duì)這類產(chǎn)品中GABA的添加情況進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控。

目前γ-氨基丁酸的檢測(cè)方法主要有薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）法、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）法、氨基酸分析儀法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法等[6-10]。其中紙層析法的精準(zhǔn)度較低，毛細(xì)管電泳法實(shí)驗(yàn)操作的過程較復(fù)雜，氨基酸自動(dòng)分析法的分析儀器價(jià)格較昂貴，而高效液相色譜法因準(zhǔn)確、高效而被廣泛應(yīng)用。因GABA本身對(duì)紫外光吸收小，一般需要衍生化后才能使用紫外檢測(cè)器檢測(cè)[11]。目前常用的衍生試劑有苯二醛-2-巰基乙醇、丹磺酰氯以及鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）等[12-15]，其中OPA具有價(jià)格便宜、衍生時(shí)間短、簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)點(diǎn)，作為一般實(shí)驗(yàn)選用的衍生試劑。但OPA的衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定、衍生后需快速進(jìn)樣[16]，故本研究采用在線柱前自動(dòng)化衍生裝置，對(duì)測(cè)定GABA的色譜條件、衍生條件及運(yùn)動(dòng)飲品的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一套系統(tǒng)性的在線柱前衍生-高效液相色譜分析運(yùn)動(dòng)型飲料中γ-氨基丁酸含量的方法，為運(yùn)動(dòng)型飲料中γ-氨基丁酸的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

運(yùn)動(dòng)型飲料：隨機(jī)購(gòu)買于超市中，標(biāo)稱為運(yùn)動(dòng)型飲料的樣品。

1.1.2 試劑

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%）：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；鄰苯二甲醛、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2695型高效液相色譜、2998型二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）、Waterssunfire C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）：美國(guó)Waters公司；Thermo hypersil gold C18柱（4.6mm×250 mm，5μm）：美國(guó)Thermo公司；Agilent Zorbax SBAQ柱（4.6mm×250mm，5μm）：美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件的優(yōu)化

采用高效液相色譜儀串聯(lián)二極管陣列檢測(cè)器對(duì)GABA進(jìn)行檢測(cè)，分別對(duì)色譜柱種類（Waterssunfire C18柱、Thermo hypersil gold C18柱、Agilent Zorbax SBAQ柱）[17-18]、流動(dòng)相種類（20mmol/L磷酸緩沖溶液-甲醇、20mmol/L乙酸鈉-乙腈）[19-20]以及檢測(cè)波長(zhǎng)（190～450 nm）3個(gè)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。其中流動(dòng)相梯度洗脫程序Ⅰ：A（20mmol/L磷酸緩沖溶液）-B（甲醇）為B 30%、0～5.0 min，B 30%～50%、5.0～12.0 min，B 50%～30%、12.0～15.0 min；流動(dòng)相梯度洗脫程序Ⅱ：A（20mmol/L乙酸鈉）-B（乙腈）為B 30%、0～5.0min，B 30%～50%、5.0～12.0min，B 50%～30%、12.0～15.0min；流動(dòng)相等度洗脫程序Ⅲ：A（20mmol/L乙酸鈉）-B（乙腈）為70∶30（V/V）。

其余色譜條件為流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：30℃。

1.3.2 柱前衍生條件的優(yōu)化

衍生試劑的制備：稱取0.1 g OPA，用1 mL乙腈溶解，加100μL巰基乙醇，用0.5mol/L的硼酸緩沖液定容至10mL，過0.22μm濾膜，4℃可保存1周。

OPA柱前衍生化具有高度靈敏性，但衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，因此，本試驗(yàn)選取不同衍生時(shí)間（0.5 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min）和不同衍生溫度（40 ℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃），采用在線柱前衍生裝置對(duì)50μg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生，初始衍生溫度為40℃，考察衍生時(shí)間及溫度對(duì)目標(biāo)物組分峰面積的影響。

具體步驟：準(zhǔn)確稱取5.0mL樣品，加入乙腈溶液5mL超聲提取10min，然后將提取液在3000r/min條件下離心10min，吸取上清液待用。取標(biāo)準(zhǔn)品液或者樣品上清液與衍生試劑在線混勻，分別分析衍生反應(yīng)時(shí)間以及衍生反應(yīng)溫度對(duì)GABA峰面積的影響。

1.3.3 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別稱取一定質(zhì)量的GABA標(biāo)準(zhǔn)品，配制成質(zhì)量濃度為1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用在線柱前衍生裝置與衍生試劑OPA衍生后分析，以GABA質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，GABA峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 萃取溶劑的選擇優(yōu)化

運(yùn)動(dòng)型飲料中γ-氨基丁酸的提取，一般選用萃取溶劑進(jìn)行萃取。本實(shí)驗(yàn)分別比較了4種不同的萃取溶劑（乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯）對(duì)GABA的萃取率的影響[21-23]。以已知GABA含量的運(yùn)動(dòng)型飲料為基質(zhì)，加入50μg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)品，比較萃取率，萃取步驟見1.3.2，選擇較優(yōu)的萃取劑進(jìn)行樣品的前處理。萃取率計(jì)算公式如下：

式中：y為萃取率，%；x為萃取后樣品中的目標(biāo)物的含量，μg/mL；xo為原樣品中目標(biāo)物的含量，μg/mL；a為樣品中加入的目標(biāo)物的含量，μg/mL。

1.3.5 回收率與精密度的測(cè)定

以已知GABA含量的運(yùn)動(dòng)型飲料為基質(zhì)，加入不同質(zhì)量濃度（5.0 mg/L、10.0 mg/L、50.0 mg/L）的GABA標(biāo)準(zhǔn)液，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件操作，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandard deviation，RSD），每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定5次?；厥章视?jì)算公式如下：

式中：Y為回收率，%；X為加標(biāo)后樣品中的GABA的含量，mg/L；XO為已知運(yùn)動(dòng)飲料中GABA的含量，mg/L；A為樣品中加入的GABA的含量，mg/L。

1.3.6 樣品的檢測(cè)

在市場(chǎng)上隨機(jī)抽取5種運(yùn)動(dòng)型飲料，采用最優(yōu)的檢測(cè)條件測(cè)定樣品中GABA的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

不同色譜柱對(duì)GABA檢測(cè)的影響結(jié)果見圖1。

圖1 3種色譜柱條件下GABA的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms ofγ-aminobutyric acid using 3 kinds of chromatographic columns

由圖1可知，GABA在Waterssunfire C18柱中基線穩(wěn)定，峰形較對(duì)稱，在其他兩種色譜柱中基線漂移、峰形響應(yīng)值不高，所以采用Waterssunfire C18柱對(duì)GABA進(jìn)行色譜分析。

2.1.2 流動(dòng)相的確定

GABA的柱前衍生物分離一般采用磷酸緩沖溶液-甲醇或者乙酸鈉-乙腈為流動(dòng)相，不同流動(dòng)相對(duì)GABA標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的影響結(jié)果見圖2。

圖2 GABA標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms ofγ-aminobutyric acid standard

由圖2可知，磷酸緩沖溶液-甲醇或者乙酸鈉-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫時(shí)，洗脫的時(shí)間較長(zhǎng)且基線不穩(wěn)。而以20 mmol/L的乙酸鈉溶液-乙腈（體積比70∶30）為流動(dòng)相等度洗脫時(shí)，GABA標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖基線穩(wěn)定且響應(yīng)值最大，12 min內(nèi)GABA能達(dá)到有效地分離。因此，最適流動(dòng)相為20 mmol/L的乙酸鈉溶液-乙腈（體積比70∶30）等度洗脫。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為了提高方法的靈敏度，選擇合適的檢測(cè)波長(zhǎng)，采用二極管陣列檢測(cè)器在檢測(cè)波長(zhǎng)190～450 nm范圍內(nèi)對(duì)GABA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。DAD的檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)GABA標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)效果的影響見圖3。

圖3 GABA的全波長(zhǎng)掃描圖Fig.3 Full wavelength scan ofγ-aminobutyric acid

由圖3可知，γ-氨基丁酸衍生物的特征吸收波長(zhǎng)有3處，其中216 nm處為最大吸收波長(zhǎng)，但此波長(zhǎng)處干擾峰較多。為了確保目標(biāo)組分既要有最大的吸收值，又要避免基質(zhì)的噪音干擾。綜合考慮，選取波長(zhǎng)247nm為GABA的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 柱前衍生條件的優(yōu)化

2.2.1 衍生時(shí)間的影響

柱前衍生時(shí)間對(duì)GABA標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的影響結(jié)果見圖4。

圖4 衍生時(shí)間對(duì)GABA峰面積的影響Fig.4 Effect of derivatization time on the peak area of γ-aminobutyric acid

由圖4可知，衍生反應(yīng)時(shí)間在2 min左右時(shí)，GABA標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積達(dá)到42，再延長(zhǎng)衍生時(shí)間，GABA的穩(wěn)定性變差，峰面積變小，由于GABA的峰面積與其測(cè)定含量為正相關(guān)，所以選擇2 min作為衍生反應(yīng)的時(shí)間。

2.2.2 衍生溫度的影響

設(shè)定OPA柱前衍生化反應(yīng)的時(shí)間為2min，衍生溫度對(duì)GABA標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的影響結(jié)果見圖5。

圖5 衍生溫度對(duì)GABA峰面積的影響Fig.5 Effect of derivatization temperature on the peak area of γ-aminobutyric acid

由圖5可知，隨著衍生溫度的升高，GABA的峰面積呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，由400增大到525。當(dāng)衍生溫度在45℃左右時(shí)，衍生物的峰面積趨于穩(wěn)定，峰面積在500左右，相差不大；當(dāng)衍生溫度＞60℃之后，衍生物不穩(wěn)定，GABA峰面積急劇下降至350，所以選擇45℃作為衍生溫度。

2.3 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以GABA含量（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。

由圖6可知，GABA質(zhì)量濃度在1.0～100.0μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，R2為0.998 6，其檢出限為0.30 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg。

圖6 γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve ofγ-aminobutyric acid

2.4 萃取溶劑優(yōu)化

不同萃取溶劑對(duì)運(yùn)動(dòng)型飲品中GABA萃取率的影響結(jié)果見圖7。

圖7 萃取溶劑對(duì)GABA萃取率的影響Fig.7 Effect of extraction solvent on the extraction rate of γ-aminobutyric acid

由圖7可知，由于運(yùn)動(dòng)型飲品中營(yíng)養(yǎng)元素較多，丙酮作為萃取劑，混合、離心后樣品溶液渾濁，乙酸乙酯為萃取劑對(duì)GABA的萃取率僅有37%，只有乙醇和乙腈萃取GABA較完全，萃取率能達(dá)到74.5%和86.7%，但是乙醇與飲品分層不明顯。因此，選擇乙腈為萃取溶劑。

2.5 加標(biāo)回收率與精密度

以未添加γ-氨基丁酸的運(yùn)動(dòng)型飲料為基質(zhì)，分別添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 方法的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的測(cè)定結(jié)果（n=5）Table 1 Determination results of the adding standard recovery rate and RSD of the method(n=5)

由表1可見，加標(biāo)回收率為82.5%～90.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.9%～3.7%，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品需要。

2.6 運(yùn)動(dòng)型飲料樣品的測(cè)定

5種運(yùn)動(dòng)型飲料中GABA的檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 5種運(yùn)動(dòng)型飲料樣品中GABA含量的測(cè)定Table 2 Determination of GABA content in 5 kinds of sports drinks samples

由表2可知，5種運(yùn)動(dòng)型飲品中都添加了GABA，含量范圍為0.32～16.38 mg/100 mL，整體與產(chǎn)品外包裝標(biāo)簽中標(biāo)出的一致，但是不同品牌之間GABA的含量具有明顯差異（P＜0.05）。消費(fèi)者在目標(biāo)性地選用含有此物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)飲料時(shí)，還是應(yīng)進(jìn)行比較，這樣會(huì)達(dá)到更有效的補(bǔ)充目的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化HPLC條件、在線柱前衍生條件及萃取條件建立了一種在線柱前衍生-高效液相色譜法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)型飲料中γ-氨基丁酸的分析方法。結(jié)果表明，色譜條件：Waters sunfire C18色譜柱，20 mmol/L的乙酸鈉溶液-乙腈（體積比70∶30）作為流動(dòng)相，二極管陣列檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)247 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20μL；在線柱前衍生條件：OPA為衍生劑，柱前衍生時(shí)間2.0 min，衍生溫度45℃。在最優(yōu)檢測(cè)條件下，GABA在1.0～100.0μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（R2=0.9986），檢出限為0.30 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg。萃取條件為乙腈為萃取溶劑，體積比1∶1，超聲提取10 min。該方法的加標(biāo)回收率為82.5%～90.6%，RSD為2.9%～3.7%，所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度，能準(zhǔn)確快速有效地檢測(cè)運(yùn)動(dòng)型飲料中GABA的含量，可為運(yùn)動(dòng)型飲料中γ-氨基丁酸的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。