固相萃取-反相高效液相色譜測定食品中大豆異黃酮含量的方法研究

馬翛然，張洛莎，王 鵬，鄭晨曦，高麗華，劉 婷*

（1.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；2.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124）

中國的傳統(tǒng)大豆食品一般可分為非發(fā)酵的和發(fā)酵的兩大類。非發(fā)酵的有整豆（如毛豆、青豆、干豆、黑豆等）、豆芽、豆?jié){、豆腐、干豆腐和油豆腐等；發(fā)酵的有醬油、豆豉、豆醬、腐乳和酸豆奶等，均各成一類，擁有很多花色品種。鑒于大豆顯著的營養(yǎng)價值和功能性質(zhì)，大豆食品被有關(guān)營養(yǎng)與食品專家認(rèn)定為21世紀(jì)全球最受歡迎的健康食品之一[1]。

大豆不僅含有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和植物油，還含有對人體健康有益并具有各種生理功能的一類天然活性物質(zhì)—大豆異黃酮[2]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。大豆異黃酮是黃酮類化合物，是大豆生長中形成的一類次級代謝產(chǎn)物，與雌激素有相似的分子結(jié)構(gòu)，同時也是一種植物多酚。其分子基本結(jié)構(gòu)為2-苯基色原酮，泛指兩個苯環(huán)通過三碳鏈相互連結(jié)而形成一系列化合物。其名稱及取代基見表1。大豆異黃酮具有雌激素活性[2-4]、降低膽固醇[2-4]、預(yù)防心血管疾病[2-4]、抑制腫瘤生長[2-4]、抗氧化性[5]、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松[6-7]和緩解婦女更年期綜合癥[8-9]等特定的生理作用以及保健功能[10-15]，受到人們廣泛的關(guān)注及重視。

圖1 8種異黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of 8 isoflavones

表1 8種異黃酮的名稱及取代基Table 1 Names and substituent groups of 8 isoflavones

目前，我國大豆制品生產(chǎn)仍存在生產(chǎn)集中度較低、小作坊多、技術(shù)水平低、設(shè)備陳舊簡陋、產(chǎn)品功能性差、資源利用率低和生產(chǎn)管理難以標(biāo)準(zhǔn)化等諸多影響產(chǎn)品質(zhì)量的瓶頸問題，而且我國現(xiàn)行的大豆異黃酮含量測定的國家標(biāo)準(zhǔn)[16-17]適用范圍小，專屬性不強(qiáng)，已不適合當(dāng)前市場上品種繁多的大豆食品中異黃酮的含量分析。因此，迫切需要建立新的大豆異黃酮分析方法以完善現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)，為有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量提供理論依據(jù)。這不僅對企業(yè)生產(chǎn)中的質(zhì)量控制有利，也有利于大豆食品的市場監(jiān)管，在國家大豆食品安全體系的建設(shè)中占有重要的地位。

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是目前應(yīng)用最廣泛的一種檢測方法，相較其他分析方法，具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、選擇性和重現(xiàn)性好的優(yōu)點。文獻(xiàn)報道[7-13，16-25]的HPLC法測定大豆異黃酮的含量所使用的提取方法、色譜分離方法以及儀器條件等均有不同，所涉及的樣品種類不同，主要有大豆[10-12，21，27-29，31]、黑豆[29]和紅豆[29]、醬油[13]、豆豉[14]、腐乳[15]、葛根[18]和三葉草[19]、膳食補(bǔ)充劑[20]、豆醬[21]、生物樣品人體尿液[22-23]和血清[24]、豆?jié){[25]等，這導(dǎo)致異黃酮提取效率、檢測結(jié)果和方法的適用范圍各異。本研究以測定大豆食品中異黃酮含量為主要內(nèi)容，在國家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上嘗試優(yōu)化黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鳶尾黃酮苷、鷹嘴豆芽素A共8種異黃酮的提取方法，擬建立了一種適用范圍廣，而且能同時測定8種異黃酮成分的高效液相色譜法，對控質(zhì)大豆食品的質(zhì)量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純）：Fisher Chemical公司；黃豆素（純度＞99.44%）、黃豆苷（純度＞99.23%）、大豆苷（純度＞98%）、大豆苷元（純度＞99.9%）、染料木素（純度＞98%）、染料木苷（純度＞98.7%）、鳶尾黃酮苷（純度＞98.86%）、鷹嘴豆芽素A（純度＞99.65%）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；高純水（電阻率＞18 MΩ）：美國密博里公司；其余試劑均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

試驗樣品為大豆及大豆制品如豆?jié){、豆奶等共23種，均為市售產(chǎn)品。樣品的名稱和配料見表2。

表2 23種樣品的名稱和配料Table 2 Names and ingredients of 23 samples

續(xù)表

1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀（HPLC），配置二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）：美國安捷倫公司；固相萃取柱（Waters Sep-pakRVac 12cc（2g）C18Cartridges）：美國Supelcol公司；pHS-3C型酸度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；H-1650型離心機(jī)：上海博翎儀器設(shè)備有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鷹嘴豆芽素A各10.0 mg于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)90%甲醇-水溶液溶解后定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液；黃豆黃素和鳶尾黃酮苷在甲醇和水中的溶解性較差，分別稱取10.0 mg于100 mL和50 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為90%甲醇溶液溶解后定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液的配制：分別移取適量體積的黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鳶尾黃酮苷、鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至10.0mL，配制成質(zhì)量濃度分別為1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、30.00μg/mL、40.00μg/mL、50.00μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3.2 大豆異黃酮提取

（1）液體樣品：準(zhǔn)確稱取1 g待測樣品，用體積分?jǐn)?shù)為90%甲醇溶液溶解定容至5 mL，搖勻后待凈化處理。

（2）固體和半固體樣品：樣品粉碎過篩后，準(zhǔn)確稱取1 g樣品于50 mL離心管中，加入25mL體積分?jǐn)?shù)為90%甲醇溶液，超聲提取30 min，經(jīng)3 000 r/min離心15 min后，吸取上清液至150 mL旋蒸瓶。再向樣品中加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為90%甲醇溶液，超聲提取30 min，3 000 r/min離心15 min后，吸取上清液至旋蒸瓶。將收集的上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，用體積分?jǐn)?shù)為90%甲醇定容至5 mL刻度管中，搖勻后待凈化處理。

1.3.3 提取液的凈化

提取液用C18固相萃取柱凈化。在凈化前，先加入10mL甲醇，再加入20 mL水活化柱子；再將上述經(jīng)預(yù)處理后的樣品提取液轉(zhuǎn)移入柱并使組分保留在柱上；用15 mL水淋洗，最大程度除去干擾物；最后，用5 mL 0.5%甲酸甲醇溶液將待測物質(zhì)洗脫下來并收集。收集液經(jīng)0.22μm有機(jī)相濾膜過濾，待高效液相色譜測定。

1.3.4 樣品加標(biāo)試驗

稱取樣品后加入適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他步驟同1.3.2。

1.3.5 色譜測定條件

色譜柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A：pH 3.10磷酸水溶液，B：乙腈；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20μL。梯度洗脫程序如表3所示。

表3 流動相梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution procedures of mobile phase

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件的選擇

2.1.1 檢測波長的確定

8種大豆異黃酮在波長190～400 nm范圍內(nèi)的紫外光譜圖見圖2。

圖2 8種大豆異黃酮的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV absorbance spectrum of 8 soybean isoflavones

從圖2看出，8種大豆異黃酮在波長240～260nm處均有最大吸收。結(jié)合參考文獻(xiàn)，比較了波長245nm[22]、254nm[18，22-24]、260 nm[5，19-21]等幾個不同波長的色譜響應(yīng)，結(jié)果表明，在波長254 nm處測定靈敏度高，且各組分峰的響應(yīng)值均較高，因此采用254 nm作為檢測波長。

2.1.2 色譜柱的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[15-32]，對大豆異黃酮的分離分析均為采用C18柱的反相高效液相色譜。比較了8種異黃酮在Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18、ZORBAX Stable Bond C18和C8三種型號的色譜柱上的分離效果，結(jié)果證明，在相同的色譜條件下SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）對異黃酮的分離效果最好，因此選擇SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱作為分析柱。

2.1.3 流動相的選擇

考察了不同流動相、pH和流動相配比對異黃酮色譜行為的影響。以含0.1%的乙酸水溶液和0.1%的乙酸乙腈溶液作流動相，在采取梯度洗脫的方式時，大豆苷和黃豆黃苷、染料木苷和鳶尾黃酮苷均沒有完全分離開；采用0.5%的甲酸水溶液和甲醇作為流動相，染料木苷和鳶尾黃酮苷沒有完全分離開，染料木素與黃豆黃苷色譜峰重合；采用0.05%三氟乙酸水溶液和乙腈作為流動相，8種異黃酮仍然無法完全達(dá)到基線分離，且鷹嘴豆芽素A的出峰時間較長；以pH 2.96～3.98的H3PO4水溶液和甲醇為流動相，通過優(yōu)化兩相的配比，8種異黃酮均可獲得滿意的分離度，而且流動相中H3PO4水溶液pH值在2.96～3.18時，異黃酮的分離效果沒有明顯差異。綜合考察各種影響因素后，采用pH 3.10的H3PO4和甲醇為流動相。

2.1.4 試樣提取方法的選擇

依據(jù)文獻(xiàn)[16-24]報道并結(jié)合分析檢測的實際情況，采用甲醇和水混合液作為異黃酮的提取溶劑。比較了甲醇和水體積比為60∶40、70∶30、80∶20、90∶10和100∶0時的提取效果，考察色譜峰峰面積與取樣量的比值，提取效果以90∶10的甲醇和水溶液為最佳，最終選擇體積比為90∶10的甲醇和水作為提取液。

考察了超聲提取時間對提取效率的影響，平行稱取同一樣品3份，分別超聲處理20min、30min、40min，計算峰面積與取樣量的比值，結(jié)果表明，超聲提取時間為30min和40min時提取效果無顯著差異，而超聲提取時間為20 min的提取效果較差。根據(jù)實驗結(jié)果，選擇超聲處理時間為30 min。

考察了固相萃取洗脫溶液對凈化效果的影響，結(jié)果選擇0.5%甲酸甲醇溶液作為洗脫溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍

分別將不同濃度的大豆異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按色譜條件進(jìn)行測定，得到8種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，見圖3。

圖3 8種大豆異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 8 soybean isoflavones mixed standard solution

表4 8種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和線性范圍Table 4 Regression equation and linear range of standard curves of 8 soybean isoflavones

以異黃酮質(zhì)量濃度（ρ，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作圖，8種異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表4。

由表4可知，8種異黃酮在質(zhì)量濃度為1.00～50.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999。

2.3 精密度試驗

以質(zhì)量濃度為20μg/mL的8種異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣8次進(jìn)行精密度試驗，分別測定8種異黃酮的含量并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表5。

由表5可知，8種異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的測定結(jié)果RSD在1.03%～4.33%的范圍內(nèi)，表明該方法精密度良好。

表5 方法精密度實驗結(jié)果Table 5 Results of precision tests of the method

2.4 加標(biāo)回收率試驗

在上述優(yōu)化后的試驗條件下，分別對樣品添加20μg/g、40μg/g和200μg/g的標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行測定，加標(biāo)回收率試驗結(jié)果見表6。

表6 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 6 Results of adding standard recovery tests

續(xù)表

由表6可知，大豆苷的回收率為79.3%～87.6%，黃豆黃苷的回收率為82.8%～86.5%，染料木苷的回收率為81.8%～88.2%，鳶尾黃酮甙的回收率為85.3%～95.1%，大豆苷元的回收率為95.6%～100.6%，黃豆黃素的回收率為94.3%～106.2%，染料木素的回收率為92.5%～104.4%，鷹嘴豆芽素A的回收率為95.6%～102.0%。測定結(jié)果表明，方法的準(zhǔn)確性良好，8種化合物的回收率結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均≤3.1%，測定方法可以滿足分析要求。

2.5 方法的檢出限和定量限

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417—2017《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》對檢出限和定量限的規(guī)定，以3∶1的信噪比確定方法的檢出限，以10倍的信噪比確定方法的定量限。黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鳶尾黃酮苷、鷹嘴豆芽素A的檢出限為0.2mg/kg，定量限為5 mg/kg。

2.6 樣品中大豆異黃酮的含量

經(jīng)測定，23種樣品中所含的大豆異黃酮的具體含量見表7。

表7 樣品中大豆異黃酮含量的測定結(jié)果Table 7 Determination results of soybean isoflavones contents in the samples mg/kg

由表7可知，腐竹中的大豆異黃酮種類豐富，并且含量較多，其中染料木苷的含量最多，為909.15mg/kg。而黃豆醬油所含大豆異黃酮最少，僅含有黃豆黃素、黃豆黃苷和大豆苷元，其中黃豆黃素的含量最多為2.55mg/kg。黑豆和黃豆中的異黃酮總量較高，分別為1354.10mg/kg和1054.51mg/kg，而郫縣豆瓣醬中未檢出大豆異黃酮。由此可見，腐竹是大豆異黃酮較為豐富的食品，大多數(shù)大豆異黃酮在加工時未被破壞，而黃豆醬油中的大豆異黃酮含量較少的原因有可能是在發(fā)酵過程中，部分大豆異黃酮降解或損失，這與周熒[15]對腐乳發(fā)酵過程中大豆異黃酮組分的變化及理化性質(zhì)的研究結(jié)論是一致的，證明在發(fā)酵過程中大豆異黃酮的總含量逐漸減少。值得注意的是，大豆異黃酮的含量不僅與加工工藝有關(guān)，也取決于大豆食品加工中使用的大豆原料。此外，大豆中的主要黃酮類物質(zhì)是黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素和染料木苷，因此在所有樣品中都沒有檢出鳶尾黃酮苷和鷹嘴豆芽素A。

3 結(jié)論

由于大豆制品的營養(yǎng)健康功效不斷被人們所認(rèn)識，我國大豆食品的生產(chǎn)和消費出現(xiàn)了空前的繁榮。我國地域廣闊，生產(chǎn)的傳統(tǒng)食用豆制品口味、品種更趨于多元化。因此，完善和提升現(xiàn)行國標(biāo)，建立適用范圍廣泛的大豆異黃酮的分析方法對于大豆食品的質(zhì)量控制和市場監(jiān)管是極其重要的。本研究建立了一種測定多種大豆、大豆制品等食品中黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鳶尾黃酮苷、鷹嘴豆芽素A共8種異黃酮含量的固相萃取-HPLC紫外光譜檢測法。該法采用甲醇水溶液提取異黃酮，提取液用C18固相萃取柱凈化，采用C18色譜柱分離，柱溫40℃，以乙腈-磷酸水溶液為流動相，流速1.0 mL/min，紫外檢測器254 nm進(jìn)行檢測，8種黃酮類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1.00～50.00μg/mL，其精密度實驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜5%，回收率在79.3%～102.5%范圍內(nèi)，檢出限為0.2 mg/kg，定量限為5 mg/kg。實驗結(jié)果表明，本方法適用范圍廣、分離度好、準(zhǔn)確性好、靈敏度高，可以作為有效控制大豆食品質(zhì)量的依據(jù)，具有一定的理論意義和應(yīng)用價值。