去泛素化酶USP13與抑癌蛋白Merlin的相互作用

徐 靜，王 星，陳大虎*

（江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116）

神經(jīng)纖維瘤?、蛐停╪eurofibromatosistype 2，NF2）是重要的抑癌基因，其編碼的Merlin蛋白表達(dá)水平的變化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。抑癌蛋白Merlin是一種細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白，在細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架之間起著連接的作用[1]。NF2基因缺失、突變或被抑制將造成Merlin蛋白缺失與失活，引起細(xì)胞失控性增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的形成[2-3]。Merlin蛋白可以調(diào)控細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)[4]，與生長(zhǎng)發(fā)育、早期胚胎發(fā)育[5]存在很大關(guān)聯(lián)性[6]，對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲起到重要作用[7-8]。因此，NF2基因介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生及Merlin蛋白的功能的研究具有十分重要的意義。Merlin蛋白的構(gòu)象和活性受翻譯后加工修飾，研究表明，Merlin蛋白可以被泛素化[9]，從而促進(jìn)底物蛋白的降解過(guò)程。但對(duì)其去泛素化的研究卻比較少。去泛素化是泛素化的一個(gè)相反過(guò)程，通過(guò)去除單泛素或多聚泛素分子可以穩(wěn)定底物蛋白水平[10]，與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)密切相關(guān)[11]。在體內(nèi)，蛋白質(zhì)泛素化與去泛素化形成動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)機(jī)體的蛋白質(zhì)功能、代謝，影響細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、免疫等[12]。

泛素特異性蛋白酶13（ubiquitin-specific peptidase 13，USP13）是去泛素化酶（deubiquitinases，DUBs）中泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases，USPs）家族中的一員，也是半胱氨酸依賴(lài)蛋白酶超家族成員之一[13]。去泛素化酶USP13通過(guò)裂解賴(lài)氨酸48（lysine 48，K48）連接的多聚泛素鏈，使泛素分子從底物蛋白中分離，從而逆轉(zhuǎn)因泛素化引起的底物蛋白的降解[14-15]。已有研究表明，USP13可以通過(guò)直接與抑癌蛋白第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白（phosphateand tensionhomology deleted onchromsometen，PTEN）結(jié)合并使其去泛素化[16]來(lái)穩(wěn)定PTEN的蛋白水平，其通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN抑制了腫瘤形成和糖酵解過(guò)程[17-18]。Merlin蛋白作為一個(gè)已知的抑癌蛋白，而且是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制作用的蛋白質(zhì)[19]，為研究Merlin蛋白是否與去泛素化酶USP13之間存在類(lèi)似的關(guān)系并且受USP13的調(diào)節(jié)。本研究通過(guò)構(gòu)建MYC-tagged Merlin與FLAG-tagged USP13表達(dá)載體，采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）和蛋白質(zhì)印跡法（western blot，WB）等方法初步研究去泛素化酶USP13和抑癌蛋白Merlin之間的關(guān)系。為進(jìn)一步研究去泛素化酶USP13對(duì)抑癌蛋白Merlin的調(diào)節(jié)作用奠定了基礎(chǔ)，為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了相關(guān)線索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒

293T細(xì)胞：江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院腫瘤分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；Trans5α感受態(tài)細(xì)胞：北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pCMV-3Tag-6（FLAGtag）、pCMV-3Tag-7（MYC tag）：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基：生工生物工程（上海）股份有限公司；杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eaglemedium，DMEM）：美國(guó)Hyclone公司。

1.1.3 試劑

酶切buffer、BamHⅠ（5000U/mL）、EcoRⅤ（2000U/mL）、XhoⅠ（2 500 U/mL）、HindⅢ（5 000 U/mL）限制性核酸內(nèi)切酶、T4連接酶（10000U/mL）、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）純化試劑盒、Trypsin胰蛋白酶、Anti-c-MYCMouse抗體、Anti-FLAG Rabbit抗體、Anti-Rabbit IgG HRP、Anti-Mouse IgG HRP、胎牛血清：北京全式金生物技術(shù)有限公司；三磷酸脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTPs）：北京索萊寶科技有限公司；1 kbp蛋白Marker：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；氨芐青霉素、Goldview染料：南京金斯瑞生物科技有限公司；protein G agerose珠子、Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制劑片劑：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；熒光顯影液：美國(guó)BIO-RAD公司；Q5高保真DNA聚合酶（5 000 U/mL）：美國(guó)NEB公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；MB-102振蕩型恒溫金屬?。汉贾莶┤湛萍加邢薰?；Centrifuge 5424 R高速冷凍離心機(jī)、Mastercycler nexus聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）儀：艾本德（中國(guó)）有限公司；SW-CJ-1FB單人超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；OPTIMAX型X射線膠片洗片機(jī)：德國(guó)布魯泰克有限公司；TL-4熒光倒置顯微鏡：中國(guó)OLYMPUS公司；Thermo 371細(xì)胞培養(yǎng)箱、Thermo 1389型超凈工作臺(tái)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)BIO-RAD公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-70生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NF2基因和USP13基因的調(diào)取

以Trizol法提取的293T細(xì)胞總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增NF2基因、USP13基因的全長(zhǎng)。NF2基因的上游引物為5′-ATTAGGATCCATGGCCGGGGCCATCGCTTCC-3′，下游引物為5′-ATGCGATATCAATGCAGATAGGTCTTCTGCCT-3′。USP13基因的上游引物為5′-ATTAAAGCTTATGCAGCGCCGGGGCGCCCTGTT-3′，下游引物為5′-TAGCCTCGAGGCTTGGTATCCTGCGGTAAAA-3′。PCR擴(kuò)增體系：上游引物、下游引物（10μmol/L）各1.25μL，模板1μL，5×Q5buffer 5μL，Q5高保真DNA聚合酶0.5μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5μL；雙蒸水（ddH2O）15.5μL。PCR擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸1 min 30 s，39個(gè)循環(huán)；72℃再延伸2 min。采用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.3.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

NF2基因表達(dá)載體NF2/pCMV-3Tag-7的構(gòu)建及鑒定：NF2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pCMV-3Tag-7分別經(jīng)核酸內(nèi)切酶（BamHⅠ、EcoRⅤ）雙酶切、純化獲得帶有粘性末端的NF2基因與載體pCMV-3Tag-7，NF2基因與載體pCMV-3Tag-7在16℃條件下過(guò)夜連接得到表達(dá)載體NF2/pCMV-3Tag-7后轉(zhuǎn)化至Trans5a感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞涂布于含50mg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，只有當(dāng)重組質(zhì)?；蛘咴假|(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞才能在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上形成克隆。然后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定并送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

USP13基因表達(dá)載體USP13/pCMV-3Tag-6的構(gòu)建及鑒定：方法同NF2基因表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定，所用載體為pCMV-3Tag-6，所用限制性核酸內(nèi)切酶為XhoⅠ、HindⅢ。1.3.3 NF2基因、USP13基因表達(dá)載體的蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染：利用陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù)[20]，轉(zhuǎn)染試劑為聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI），將表達(dá)載體NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6分別轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。具體操作：用500μL無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM與PEI、表達(dá)載體混合，PEI與表達(dá)載體的比例為3μL∶1μg，室溫放置30 min。同時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM替換293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中的完全培養(yǎng)基。將混合液均勻滴入293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)5 h后用完全培養(yǎng)基替換，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

蛋白提?。河?℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer saline，PBS）洗滌細(xì)胞，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，混合液經(jīng)2 500 r/min離心2 min，棄上清，收集細(xì)胞。加入60～100μL RIPA裂解液（每15 mL加一片蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞，冰上孵育15～30 min，4℃離心10 000～14 000 r/min，取上清，獲得細(xì)胞總蛋白。其中RIPA裂解液：10 mmol/L Tris（pH 7.4）、150 mmol/L NaCl、1%脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、1%乙基苯基聚乙二醇（nonidet p 40，NP-40）。

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：取60μL細(xì)胞蛋白提取液，加入12μL 5×蛋白上樣緩沖液，100℃變性8 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白上樣量為10～20μL。

WB：轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride，PVDF）的條件是250 mA、2h。用5%的脫脂牛奶對(duì)膜進(jìn)行封閉2h以上。分別加Anti-FLAGRabbit抗體（檢測(cè)USP13）或Anti-c-MYCMouse抗體（檢測(cè)Merlin）4℃過(guò)夜，抗體與脫脂牛奶體積比為1μL∶3 000μL，加辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗，二抗與脫脂牛奶體積為1μL∶5 000μL。經(jīng)洗膜、顯影液化學(xué)發(fā)光，最后用OPTIMAX X光洗片機(jī)對(duì)膜進(jìn)行曝光洗片，并記錄結(jié)果。其中5%的脫脂牛奶由0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液-0.4%吐溫20（phosphate buffer solution-tween-20，PBS-T）配制。

1.3.4 免疫共沉淀驗(yàn)證Merlin與USP13相互作用

按照方法1.3.3，將表達(dá)載體NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，培養(yǎng)48～72 h后收取細(xì)胞，用100～200μL RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞，獲得細(xì)胞蛋白，獲得的蛋白提取液一部分進(jìn)行Input試驗(yàn)，檢測(cè)共轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒表達(dá)情況。Input表達(dá)良好后，進(jìn)行Co-IP。Co-IP條件：取5μL對(duì)應(yīng)抗體于蛋白提取液中，在旋轉(zhuǎn)儀上4℃旋轉(zhuǎn)1～2h，加入30～50μLprotein Gagerose珠子，4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜，用IPBuffer洗珠子3～5次，100℃煮樣品6～8min。然后進(jìn)行WB檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行記錄及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NF2基因和USP13基因的調(diào)取結(jié)果

NF2基因與USP13基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 NF2基因（a）和USP13基因（b）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products of NF2 gene(a)and USP13 gene(b)

由圖1a可知，堿基長(zhǎng)度在1 650～2 000 bp范圍內(nèi)有明顯的目的條帶，NF2基因的片段約為1 700 bp。由圖1b可知，堿基長(zhǎng)度在2 000～3 000 bp范圍內(nèi)有明顯的目的條帶，USP13基因的片段約為2 500 bp，表明NF2基因和USP13基因調(diào)取成功。

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

從含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行酶切鑒定，表達(dá)載體NF2/pCMV-3Tag-7用BamHⅠ、EcoRⅤ進(jìn)行雙酶切，USP13/pCMV-3Tag-6用XhoⅠ、HindⅢ進(jìn)行雙酶切。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 表達(dá)載體NF2/pCMV-3Tag-7（a）與USP13/pCMV-3Tag-6（b）的鑒定Fig.2 Identification of expression vectors NF2/pCMV-3Tag-7(a)and USP13/pCMV-3Tag-6(b)

由圖2可知，表達(dá)載體NF2/pCMV-3Tag-7及USP13/pCMV-3Tag-6經(jīng)雙酶切后，載體和目的片段分開(kāi)，與Marker對(duì)比，目的片段大小正確，表明兩個(gè)表達(dá)載體構(gòu)建完成。

2.3 蛋白表達(dá)的檢測(cè)

Merlin蛋白表達(dá)的檢測(cè)：將NF2/pCMV-3Tag-7表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，培養(yǎng)48～72 h后裂解細(xì)胞收集蛋白，采用鼠抗MYC進(jìn)行WB檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 Merlin蛋白表達(dá)的WB檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Determination results of expression of the Merlin protein by WB

由圖3可知，從內(nèi)參蛋白β-Actin可以看出，兩個(gè)樣品上樣量基本相同。轉(zhuǎn)入表達(dá)載體NF2/pCMV-3Tag-7的細(xì)胞表達(dá)的蛋白在相應(yīng)的分子質(zhì)量大小處有明顯的目的條帶，而轉(zhuǎn)入載體pCMV-3Tag-7的細(xì)胞表達(dá)的蛋白無(wú)目的條帶，表明構(gòu)建的表達(dá)載體在293T細(xì)胞中有效表達(dá)Merlin蛋白。

去泛素化酶USP13表達(dá)的檢測(cè)：將USP13/pCMV-3Tag-6表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，培養(yǎng)48～72 h后裂解細(xì)胞收集蛋白，用兔抗FLAG進(jìn)行WB檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 去泛素化酶USP13蛋白表達(dá)的WB檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Determination results of expression of the deubiquitinase USP13 protein by WB

由圖4可知，轉(zhuǎn)入表達(dá)載體USP13/pCMV-3Tag-6的細(xì)胞表達(dá)的蛋白在相應(yīng)的分子質(zhì)量大小處有明顯的條帶，而轉(zhuǎn)入載體pCMV-3Tag-6的細(xì)胞表達(dá)的蛋白在對(duì)應(yīng)位置無(wú)條帶，表明構(gòu)建的表達(dá)載體在293T細(xì)胞中有效表達(dá)去泛素化酶USP13。與內(nèi)參蛋白相比較，去泛素化酶USP13在293T細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)較高。

2.4 Merlin蛋白與USP13蛋白的相互作用

Co-IP是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的有效方法。目前，免疫共沉淀廣泛應(yīng)用于研究生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)間的相互作用。為檢測(cè)Merlin蛋白與去泛素化酶USP13是否存在相互作用的關(guān)系。將表達(dá)載體NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，收集蛋白后，用鼠抗MYC對(duì)Merlin蛋白進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)，用兔抗FLAG對(duì)Merlin蛋白做WB檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，鼠抗MYC將MYC-Merlin蛋白沉淀下來(lái)的同時(shí)，經(jīng)WB可檢測(cè)到FLAG-USP13蛋白，而加入無(wú)關(guān)抗體IgG的體系中未檢測(cè)到FLAG-USP13蛋白，說(shuō)明Merlin蛋白與去泛素化酶USP13在細(xì)胞內(nèi)可以相互作用。

為了進(jìn)一步探討及驗(yàn)證Merlin蛋白與去泛素化酶USP13相互作用的特異性與真實(shí)性，因此，采用用兔抗FLAG對(duì)去泛素化酶USP13做Co-IP實(shí)驗(yàn)，用鼠抗MYC對(duì)Merlin蛋白進(jìn)行WB檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

從圖6可以看出，三組樣品的Merlin蛋白與去泛素化酶USP13均表達(dá)良好，表明這兩個(gè)蛋白在293T細(xì)胞中共表達(dá)。同樣，兔抗FLAG對(duì)去泛素化酶USP13做Co-IP時(shí)，WB檢測(cè)到MYC-Merlin蛋白的表達(dá)，IgG作為無(wú)關(guān)抗體時(shí)未檢測(cè)到MYC-Merlin蛋白，說(shuō)明Merlin蛋白與去泛素化酶USP13之間確實(shí)存在特異地相互作用關(guān)系。

圖5 Merlin蛋白與去泛素化酶USP13的免疫共沉淀正方向結(jié)果Fig.5 Positive results of Co-IP of the Merlin protein and the deubiquitinase USP13

圖6 Merlin蛋白與去泛素化酶USP13的免疫共沉淀反方向結(jié)果Fig.6 Negative results of Co-IP of the Merlin protein and the deubiquitinase USP13

3 結(jié)論

本研究從293T細(xì)胞中成功調(diào)取NF2及USP13基因，構(gòu)建表達(dá)載體NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6后共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，證明Merlin蛋白與去泛素化酶USP13之間具有相互作用。去泛素化酶USP13是否對(duì)Merlin蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平有所影響有待后期的進(jìn)一步研究。后期還需確定去泛素化酶USP13與Merlin蛋白的調(diào)節(jié)關(guān)系，以及這兩個(gè)蛋白相互作用的功能域，并了解其對(duì)腫瘤細(xì)胞的功能性影響。這兩種基因與人類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān)，此研究為進(jìn)一步研究Merlin蛋白與去泛素化酶USP13之間的調(diào)節(jié)關(guān)系及其在腫瘤中的有關(guān)作用提供了參考，對(duì)于揭示抑癌蛋白Merlin的功能具有生物學(xué)意義。