米根霉發(fā)酵木薯淀粉產(chǎn)L-乳酸的工藝優(yōu)化

黃玉龍，石鵬霞，武 澤，孫若詩，康三江，張 芳*

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070；2.西北師范大學(xué) 甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070）

L-乳酸是廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、皮革、紡織等行業(yè)的食用有機酸和化學(xué)原料。由于L-型乳酸在人和哺乳動物體內(nèi)能夠直接參與代謝并被全部吸收[1]，從人體營養(yǎng)以及代謝的角度來看，L-乳酸更受青睞。世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）建議使用L-乳酸含量較高的產(chǎn)品，尤其是生產(chǎn)嬰幼兒營養(yǎng)食品應(yīng)避免使用D-乳酸或D，L-乳酸[2-3]。發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸常用的微生物主要有乳酸菌和根霉菌[4]，采用米根霉（Rhizopus oryzae）發(fā)酵L-乳酸明顯具有營養(yǎng)要求簡單、發(fā)酵時間短、底物轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)物易回收等優(yōu)點，目前國內(nèi)多采用此方法生產(chǎn)L-乳酸，但存在發(fā)酵產(chǎn)率較低的缺點。BAID M等[5]通過馴化改良的米根霉HZS6菌株發(fā)酵玉米芯水解液，提高了菌株對木糖和葡萄糖的利用率，L-乳酸濃度比馴化前提高1倍，達(dá)到65 g/L。米根霉在一定量氮源的高糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生和分泌乳酸，其首選發(fā)酵底物為淀粉基原料，L-乳酸對淀粉的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到0.87～0.97 g/g，發(fā)酵方式有菌種固定化發(fā)酵、液體深層游離發(fā)酵等[6-8]。PIMTONGV等[9-10]采用細(xì)胞固定化于纖維基質(zhì)上的米根霉NRRL395在靜態(tài)床發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，通過高葡萄糖質(zhì)量濃度（150 g/L）發(fā)酵，L-乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)效率分別為75.28 g/L和1.05 g/（L·h）。FU Y Q等[11]采用加裝液體過濾和組分收集改良裝置的發(fā)酵罐一步法發(fā)酵策略，發(fā)酵液中最大乳酸質(zhì)量濃度和產(chǎn)酸效率分別為158 g/L和5.45 g/（L·h），比常規(guī)發(fā)酵的最好結(jié)果高177%和366%。本試驗選取米根霉為發(fā)酵菌種，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了系統(tǒng)研究，得出以木薯淀粉糖化液作為碳源米根霉發(fā)酵L-乳酸的最優(yōu)發(fā)酵條件，旨在為不同原料發(fā)酵L-乳酸提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 糖化液及菌株

木薯淀粉糖化液：超聲波細(xì)胞粉碎機對木薯淀粉進行預(yù)處理，耐高溫α-淀粉酶和糖化酶協(xié)同對木薯淀粉進行酶解，經(jīng)測定糖化液還原糖含量為454.63 g/L。

米根霉（Rhizopusoryzae），編號BNCC336321：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CaCO3、CuSO4（均為分析純）、異丙醇（色譜純）：天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；蛋白胨、酵母浸膏、麥芽粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)公司；L-乳酸（純度≥99.5%）、D-乳酸（純度≥99.5%）標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma Aidrich公司。

種子培養(yǎng)基（采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基）：取麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基成品40 g，加入1 000 mL蒸餾水，自然pH，121℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木薯淀粉糖化液260 g/L，蛋白胨4 g，酵母浸膏3 g，麥芽粉10 g，KH2PO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，ZnSO4·7H2O 0.3 g，CaCO345 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1000紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司；HR40-ⅡA2生物安全柜：青島海爾特種電器公司；LRH-250-G光照培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；L-535R離心機：湘儀離心機儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計：上海三信儀表有限公司；SBA-40D生物傳感器：山東省科學(xué)院；MCIGEL CRS10W液相手性柱（4.6 mm×50 mm，3μm）：日本三菱化學(xué)集團；Ultimate 3000高效液相色譜儀：美國Thermo Fisher Scientific公司：WZZ-2B自動旋光儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米根霉的活化

將4℃保存的米根霉凍干粉用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精擦拭管壁，移入安全柜用小砂輪劃圈后敲斷管壁。將0.3mL左右無菌水注入凍干管中，吹打，充分溶解成菌懸液。吸取米根霉菌懸液打入3個5°Bé麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基的平板，在28℃培養(yǎng)5～7 d。復(fù)蘇后再傳代1～2次恢復(fù)活力后使用。將恢復(fù)活力后的菌種接入已酶解后的糖化液為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，即可進行糖化液發(fā)酵L-乳酸試驗[12]。

1.3.2 米根霉生長曲線的繪制

取6%活化后的菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，每組3個平行，在28℃靜置培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣在波長600 nm處測定菌體密度OD600nm值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以所對應(yīng)的OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制米根霉菌種生長曲線。選擇對數(shù)生長中后期作為該菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中的種齡。

1.3.3 培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗

以木薯淀粉糖化液為唯一碳源，通過單因素試驗，研究各成分對L-乳酸發(fā)酵的影響。培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方為：糖化液250 g/L、蛋白胨6 g/L、酵母膏4 g/L、麥芽粉10 g/L、KH2PO40.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L、ZnSO4·7H2O 0.3 g/L、CaCO345 g/L。單因素變量梯度為：糖化液添加量（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L）、蛋白胨添加量（2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L）、酵母浸膏添加量（1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L）、麥芽粉添加量（2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L、15.0 g/L）。

1.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

在培養(yǎng)基配方單因素優(yōu)化試驗的基礎(chǔ)上，研究培養(yǎng)條件中的培養(yǎng)溫度（22℃、25℃、28℃、31℃、34℃）、初始pH值為（4.2、5.2、6.2、7.2、8.2）、培養(yǎng)時間（24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）對L-乳酸發(fā)酵的影響。培養(yǎng)條件的其他參數(shù)為培養(yǎng)溫度28℃、pH 5.20、靜置培養(yǎng)時間72 h、接種量6%。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化米根霉發(fā)酵工藝條件

在培養(yǎng)基配方單因素和培養(yǎng)條件單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取影響L-乳酸發(fā)酵的主要因素糖化液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度以及初始pH值為考察變量，選取L-乳酸含量（Y）為評價指標(biāo)，采用Design Expert 8.0.6設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化驗，試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 米根霉發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for Rhizopus oryzae fermentation conditions optimization

1.3.6 分析檢測

（1）L-乳酸含量的測定

L-乳酸含量、殘?zhí)鞘Ｓ嗔康臏y定采用SBA-40D型生物傳感器[13]。

式中：c為葡萄糖對L-乳酸的轉(zhuǎn)化率，%；c1為L-乳酸產(chǎn)量濃度，g/L；c2為初始糖濃度，g/L；c3為木薯淀粉糖化液的百分?jǐn)?shù)，%；m為木薯淀粉的質(zhì)量，g；DE為木薯淀粉的糖化率，%。

（2）L-乳酸的純度分析

L-乳酸的純度分析采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）法。其色譜條件為MCIGEL CRS10W手性柱；流動相：2 mmol/L CuSO4∶異丙醇=95∶5（V/V），流速0.5 mL/min，柱溫30℃；檢測波長254 nm，紫外檢測器，進樣量10 μL[14]。

L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5mg，加1 mL超純水制成2.5 mg/mL的L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品母液。取適量母液分別稀釋成1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL和5.0mg/mL的L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)液置于1.5mLEP管中，用0.22μm孔徑濾頭過濾，使用平頭進樣器進樣10μL，測其峰面積。以L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)液的各質(zhì)量濃度（x）對應(yīng)的峰面積（y）制作L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)曲回歸方程為：y=266.47x+28.40（相關(guān)系數(shù)R2=0.998 5）。

（3）L-乳酸發(fā)酵液比旋光度的測定

依據(jù)池利民等[15]測定麥芽糖比旋光度的方法略作修改：取L-乳酸發(fā)酵液加入10cm測定管中，于20℃、589.44 nm鈉單色光源條件下測定樣品的比旋光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 米根霉生長曲線

通過米根霉菌體生長曲線可知菌體生長狀況，選擇菌體濃度適宜、菌體及產(chǎn)酶活力較高時的菌液用于接種發(fā)酵[16]。由圖1可知，米根霉在0～4 h為適應(yīng)期，生長4 h左右進入了對數(shù)期，大約20h進入穩(wěn)定期，在24h左右進入衰亡期。由于通常情況下18 h的菌種活力比較高，適于發(fā)酵乳酸，故選擇18 h的種子進行發(fā)酵試驗。

圖1 米根霉生長曲線圖Fig.1 Growth curve of Rhizopus oryzae

2.2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 糖化液添加量對L-乳酸發(fā)酵的影響

米根霉可利用的碳源很廣泛，糖類、淀粉、糖蜜和纖維素等都能用來發(fā)酵乳酸。以木薯淀粉糖化液為碳源進行乳酸發(fā)酵，從理論上講，提高淀粉糖化液的濃度會增加乳酸產(chǎn)量，但菌種對高濃度底物的耐受能力是固定的，初糖濃度太高，會使發(fā)酵周期延長，影響L-乳酸的生產(chǎn)能力，因此，有必要確定最佳糖化液濃度[17]。由圖2可知，當(dāng)糖化液添加量較低時，L-乳酸產(chǎn)量較低；隨著糖化液添加量的增加，米根霉產(chǎn)酸能力也逐漸上升，在糖化液添加量為25 g/L時達(dá)最大值77.5g/L，此時發(fā)酵液中L-乳酸含量顯著高于其他試驗組（P＜0.05），之后隨糖化液添加量＞25 g/L，增加L-乳酸含量有所下降。因此，選擇最佳糖化液添加量為25%。

圖2 糖化液添加量對L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of saccharification liquid addition on L-lactic acid fermentation

2.2.2 蛋白胨添加量對L-乳酸發(fā)酵的影響

圖3 蛋白胨添加量對L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of peptone addition on L-lactic acid fermentation

由圖3可知，蛋白胨添加量為6 g/L和8 g/L時，發(fā)酵液中L-乳酸的含量顯著高于蛋白胨添加量為2g/L、4g/L和10g/L時L-乳酸的含量（P＜0.05）。原因可能是，對根霉菌而言，其主要營養(yǎng)成分是可溶性蛋白、磷酸鹽和銨鹽等，發(fā)酵時添加的蛋白胨過少，不利于菌體生長，產(chǎn)酸量較低；當(dāng)其濃度過高時，菌體生長過于旺盛，菌體消耗過多的營養(yǎng)用于生長，產(chǎn)酸量反而下降。因此，選擇最適蛋白胨添加量為6g/L。

2.2.3 酵母浸膏添加量對L-乳酸發(fā)酵的影響

由圖4可知，酵母浸膏添加量為3 g/L、4 g/L和5 g/L時，發(fā)酵液中L-乳酸的含量顯著高于其他的試驗組（P＜0.05），隨著酵母浸膏添加量增加，發(fā)酵液中L-乳酸含量呈先增后減的趨勢。這可能是因為酵母浸膏中含有的嘌呤、嘧啶以及B族維生素等堿基和維生素是米根霉生長和產(chǎn)酸的必需因子，酵母浸膏添加量低時，有利于L-乳酸發(fā)酵，酵母浸膏含量高導(dǎo)致營養(yǎng)過剩，不利于L-乳酸發(fā)酵，反而促進了菌體的生長[18]。因此，選擇最適酵母浸膏添加量為3 g/L。

圖4 酵母浸膏添加量對L-乳酸發(fā)酵的影響由Fig.4 Effect of yeast extract addition on L-lactic acid fermentation

2.2.4 麥芽粉添加量對L-乳酸發(fā)酵的影響

圖5 麥芽粉添加量對L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of malt powder addition on L-lactic acid fermentation

由圖5可知，麥芽粉添加量為10.0g/L、12.5g/L和15.0g/L時，發(fā)酵液中L-乳酸的含量顯著高于麥芽粉添加量為2.5g/L、5.0 g/L和7.5 g/L時發(fā)酵液中L-乳酸的含量（P＜0.05），且麥芽粉添加量從2.5～15.0 g/L，L-乳酸含量逐漸上升，在10.0 g/L和12.5 g/L時達(dá)最大值后又出現(xiàn)下降的趨勢。原因可能是在L-乳酸發(fā)酵的過程中，麥芽粉除提供氮源等營養(yǎng)外，可能還具有發(fā)酵所必需的某些因子，隨著發(fā)酵因子的增加，菌種生長越來越旺盛，對底物的消耗增加，造成產(chǎn)酸量下降。因此，考慮成本、發(fā)酵效率等因素，選擇最佳麥芽粉添加量為10.0 g/L。

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 接種量對L-乳酸發(fā)酵的影響

不同的接種量對乳酸發(fā)酵結(jié)果有不同的影響，接種量過少，就會延長發(fā)酵的周期，降低生產(chǎn)效率；接種量過多，菌種生長過旺，消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，降低原料的轉(zhuǎn)化率，造成成本的提高。由圖6可知，接種量為6%時，L-乳酸的產(chǎn)量顯著高于接種量為2%、4%、8%、10%的L-乳酸產(chǎn)量（P＜0.05）。因此，選擇最適接種量為6%。

圖6 接種量對L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of inoculum on L-lactic acid fermentation

2.3.2 培養(yǎng)溫度對L-乳酸發(fā)酵的影響

培養(yǎng)溫度對米根霉L-乳酸發(fā)酵的影響。由圖7可知，L-乳酸的含量隨培養(yǎng)溫度的升高出現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃時，L-乳酸的產(chǎn)量顯著高于培養(yǎng)溫度為22℃、25℃、31℃和34℃時的L-乳酸產(chǎn)量（P＜0.05）。說明溫度的變化影響了各種酶反應(yīng)的速率，培養(yǎng)溫度升高酶反應(yīng)速率增大、生長代謝加快，產(chǎn)物生成提前；但是溫度過高，酶自身越容易失活，菌體加快衰老，最終影響產(chǎn)量[19]。因此，選擇最適培養(yǎng)溫度為28℃。

圖7 培養(yǎng)溫度對L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of culture temperature on L-lactic acid fermentation

2.3.3 初始pH對L-乳酸發(fā)酵的影響

圖8 初始pH值對L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.8 Effect of initial pH value on L-lactic acid fermentation

pH過高或過低都會對發(fā)酵過程中的酶有影響?？疾靝H 4.2～8.2范圍內(nèi)米根霉發(fā)酵L-乳酸的變化規(guī)律，結(jié)果見圖8。由圖8可知，pH 4.2～5.2，L-乳酸的含量呈增加趨勢，pH 5.2～8.2，L-乳酸的含量則呈降低趨勢；當(dāng)pH 5.2時，L-乳酸的產(chǎn)量顯著高于pH 4.2、pH 6.2、pH 7.2、pH 8.2的L-乳酸產(chǎn)量（P＜0.05）。因此，選擇最適初始pH值為5.2。

2.3.4 培養(yǎng)時間對L-乳酸發(fā)酵的影響

圖9 培養(yǎng)時間對L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.9 Effect of culture time on L-lactic acid fermentation

由圖9可知，當(dāng)培養(yǎng)時間為24～72 h時，L-乳酸的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加；當(dāng)培養(yǎng)時間＞72 h時，L-乳酸的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長而不再有明顯的變化。顯著性分析可知，培養(yǎng)時間為72 h、96 h、120 h和144 h時，發(fā)酵液中L-乳酸的含量顯著高于培養(yǎng)時間為24 h、48 h時發(fā)酵液中L-乳酸的含量（P＜0.05），而培養(yǎng)時間為72 h、96 h、120 h和144 h時，發(fā)酵液中L-乳酸的含量不具有顯著性（P＞0.05），可能是培養(yǎng)時間過長，菌體死亡率加大，導(dǎo)致微生物代謝能力降低，也可能是發(fā)酵時間過長，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)已接近消耗殆盡[20]。因此，選擇最適培養(yǎng)時間為72 h。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化米根霉發(fā)酵工藝條件

2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以L-乳酸產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，選取糖化液添加量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度以及初始pH設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面分析方法，優(yōu)化L-乳酸的發(fā)酵工藝條件，響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 米根霉發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments design for Rhizopus oryzae fermentation conditions optimization

續(xù)表

2.4.2 回歸模型的建立與分析

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用響應(yīng)面軟件對表2試驗數(shù)據(jù)對其進行分析，得回歸方程：

通過回歸模型分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)（表3）可知，模型P＜0.0001，說明該模型極顯著；失擬項P=0.198 9＞0.05，失擬項不顯著；一次項（A、B、C、D）、二次項（A2、B2、C2、D2）的P值都＜0.05，對結(jié)果影響顯著。通過以上數(shù)據(jù)可看出，該模型擬合程度良好，可以用此模型來描述以上發(fā)酵因素與L-乳酸發(fā)酵之間的關(guān)系。

由回歸方程分析可得出，4個因素對米根霉發(fā)酵L-乳酸工藝的影響從大到小的順序依次是C（培養(yǎng)溫度）＞A（糖化液濃度）＞D（初始pH）＞B（培養(yǎng)時間）；交互效應(yīng)對米根霉發(fā)酵L-乳酸的影響從大到小的順序依次是AC＞CD＞AB＞BC＞BD＞AD。

該模型擬合度R2=0.94，說明試驗的誤差較小，擬合度良好；變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為2.86%，說明此模型試驗的可靠性高；預(yù)測擬合度（0.71）與矯正擬合度（0.89）接近，試驗性噪比為13.43。通過以上數(shù)據(jù)可得出，該模型擬合程度良好，可以用此模型來描述以上發(fā)酵因素與L-乳酸發(fā)酵之間的關(guān)系。

2.4.3 優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)和驗證模型

經(jīng)優(yōu)化得米根霉發(fā)酵L-乳酸的理論模型預(yù)期條件為糖化液質(zhì)量分?jǐn)?shù)26.33%，培養(yǎng)時間79.58 h，培養(yǎng)溫度28.95℃，初始pH 5.52，在此條件下，L-乳酸含量的理論值為87.35g/L。

為了驗證該試驗是否可行，采用優(yōu)化后的試驗條件進行米根霉發(fā)酵L-乳酸的驗證試驗，同時考慮到實際操作的可控性，將試驗條件稍作修訂，以修訂后的試驗條件（糖化液質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%，培養(yǎng)時間80 h，培養(yǎng)溫度29℃，初始pH 5.5）進行3次重復(fù)試驗，測定出發(fā)酵液中L-乳酸含量實際平均值為84.33 g/L。

2.5 L-乳酸的生成量、殘?zhí)鞘Ｓ嗔考捌咸烟菍-乳酸的轉(zhuǎn)化率

按本試驗最佳配比配制米根霉發(fā)酵培養(yǎng)基（糖化液添加量26%（葡萄糖含量約為118 g/L），蛋白胨6 g/L，酵母浸膏4g/L，麥芽粉10g/L，KH2PO40.3g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.3g/L，CaCO345g/L，采用米根霉發(fā)酵L-乳酸最佳培養(yǎng)條件（培養(yǎng)時間80 h，培養(yǎng)溫度29℃，初始pH 5.5，接種量6%）進行培養(yǎng)，每隔10 h取樣檢測繪制米根霉發(fā)酵L-乳酸發(fā)酵曲線，結(jié)果見圖10。

由圖10可知，木薯淀粉糖化液剛開始用于生產(chǎn)L-乳酸時，L-乳酸積累量很少；30 h時L-乳酸開始出現(xiàn)線性增長，而糖化液中葡萄糖剩余量在20 h左右也出現(xiàn)線性降低；至60 h時L-乳酸積累已逐漸平穩(wěn)，而糖化液中葡萄糖剩余量已基本耗盡；80 h時，L-乳酸積累量最大，葡萄糖含量接近零，發(fā)酵結(jié)束。L-乳酸含量以84.33 g/L計算，整個發(fā)酵過程葡萄糖對L-乳酸的最大轉(zhuǎn)化率為71.34%。

圖10 培養(yǎng)時間對L-乳酸得率的影響Fig.10 Effect of culture time on the yield of L-lactic acid

2.6 HPLC對發(fā)酵液中L-乳酸的定性及光學(xué)純度分析

糖化液質(zhì)量濃度260 g/L時的葡萄糖含量約為118 g/L，發(fā)酵結(jié)束后L-乳酸產(chǎn)量為84.33 g/L，葡萄糖對L-乳酸的轉(zhuǎn)化率為71.34%。將處理好的發(fā)酵液與乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進行HPLC分析，乳酸混標(biāo)及發(fā)酵液高效液相色譜圖見圖11。由圖11可知，發(fā)酵液中以L-乳酸為主。采用高效液相色譜法[21]分析發(fā)酵液，得到L-乳酸的光學(xué)純度為75.62%。選用比旋光度計測定米根霉發(fā)酵液的比旋光度，其數(shù)值為+2.12，說明發(fā)酵液中主要以L-乳酸為主，含有少量的D-乳酸。

圖11 乳酸混標(biāo)（A）及發(fā)酵液（B）的高效液相色譜圖Fig.11 HPLC chromatogram of lactic acid mixed standard(A)and fermentation broth(B)

3 結(jié)論

選取培養(yǎng)18 h的米根霉菌種，在響應(yīng)面優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方（糖化液添加量26%，蛋白胨6g/L，酵母浸膏4g/L，麥芽粉10 g/L，KH2PO40.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，CaCO345 g/L，ZnSO4·7H2O 0.3 g/L）和優(yōu)化后的培養(yǎng)條件（培養(yǎng)時間80 h，培養(yǎng)溫度29℃，pH 5.5，接種量6%）條件下，發(fā)酵液中L-乳酸的含量可達(dá)84.33 g/L，此時，葡萄糖對L-乳酸的轉(zhuǎn)化率為71.34%。根據(jù)HPLC對米根霉發(fā)酵產(chǎn)物定性及光學(xué)純度的分析，可知發(fā)酵液中L-乳酸的光學(xué)純度為75.62%，用比旋光度計測定發(fā)酵液的比旋光度，其值為+2.12。