聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測豆制品中轉(zhuǎn)基因成分的研究概述

孟 靜，任易婕，孫瀟慧，鐘麗霞，霍勝楠

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101）

1 轉(zhuǎn)基因大豆的概述

大豆作為主要的糧食作物和油品原料，不管在農(nóng)業(yè)發(fā)達(dá)還是不發(fā)達(dá)地區(qū)，種植面積都占有較大的比例。早期主要依靠農(nóng)藥來對抗植物病蟲害，提高產(chǎn)量，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展迅猛，尤其是轉(zhuǎn)基因大豆，抗病蟲害、抗除草劑等外源基因的表達(dá)在種植方面的優(yōu)勢使得大豆的種植面積和產(chǎn)量有了重大突破，2017年大豆產(chǎn)量3.34億t，這在很大程度上依賴于轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

2017年我國大豆進(jìn)口量達(dá)到9 500多萬t，占全球大豆貿(mào)易量的70%左右，已是世界第一大豆進(jìn)口國。全球最大的大豆出口國—美國的轉(zhuǎn)基因大豆種植比例為95%，阿根廷、巴西幾乎全部種植轉(zhuǎn)基因大豆。所以在全球大豆貿(mào)易中，主要是轉(zhuǎn)基因大豆。國內(nèi)市場大豆主要用于兩方面：一是飼料豆粕及初級加工食品原料，二是食用豆油。中國人口眾多，滿足民眾的消費(fèi)需求是大豆進(jìn)口的主要原因。大豆含有豐富的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，可制作成深受人們喜愛的各種菜肴，除食品外，大豆還廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。楊永存等[1]調(diào)查了2012-2015年深圳市售大豆中轉(zhuǎn)基因大豆的銷售及標(biāo)識情況，轉(zhuǎn)基因陽性率為6.71%。黃靖等[2]在廣州抽取的豆制品，轉(zhuǎn)基因檢出率超過50%，但在其產(chǎn)品上未進(jìn)行有效標(biāo)識。孟彥辰等[3]調(diào)查了轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度、現(xiàn)狀及存在的缺陷，指出我國目前需要制定的一系列轉(zhuǎn)基相關(guān)法律制度。

我國先后發(fā)布了《中華人民共和國種子法》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》等相關(guān)法律法規(guī)，對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的進(jìn)口、種植、使用、監(jiān)管作出了明確的體系要求。進(jìn)口用做加工原料的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，不得改變用途，目前我國除轉(zhuǎn)基因棉花和番木瓜的種植外，沒有批準(zhǔn)其他轉(zhuǎn)基因糧食作物種子在中國境內(nèi)種植。農(nóng)業(yè)部有關(guān)負(fù)責(zé)人表示，我國對轉(zhuǎn)基因工作的要求是明確的，即研究上要大膽，堅(jiān)持自主創(chuàng)新；推廣上要慎重，做到確保安全；管理上要嚴(yán)格，堅(jiān)持依法監(jiān)管。2017年中央1號文件強(qiáng)調(diào)，要“加強(qiáng)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)和監(jiān)管，在確保安全的基礎(chǔ)上慎重推廣”。

2 豆制品轉(zhuǎn)基因的檢測

目前，國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)方法主要有兩種，第一種是以核酸為檢測目標(biāo)物的方法[4]；第二種是以特定的表達(dá)蛋白為目標(biāo)物的檢測方法，包括蛋白質(zhì)單向電泳、雙向電泳、Western雜交分析及酶聯(lián)免疫分析技術(shù)[5]。核酸檢測是研究最多、應(yīng)用最為廣泛的，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（poly-merase chain reaction，PCR）、探針雜交法等，所有這些應(yīng)用都是以從樣本中提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）為整個(gè)檢測的基礎(chǔ)，而食品原料經(jīng)過不同方式處理，成品中DNA片段的大小也不盡相同。

我國豆制品的加工工藝主要包括高溫蒸煮、磨粉成漿、壓榨、發(fā)酵抽提等，不同的加工方式對基因組的影響不同。根據(jù)對核酸的破壞和保留程度，加工方式分為初級加工和深加工，初級加工有磨粉、高溫蒸煮等，壓榨和發(fā)酵抽提則屬于深加工方式。TIAN F等[6]研究了不同溫度對豆制品中核酸的破壞程度，發(fā)現(xiàn)溫度越高，DNA破壞程度越大；陳穎等[7]發(fā)現(xiàn)物理過程（如磨漿、高溫加熱）可使DNA片段降解一半甚至更多；王超等[8-9]調(diào)查了豆粉、豆干、豆腐、豆?jié){和腐竹等6種產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因情況，樣品均提取到了高質(zhì)量的基因組DNA，建立了穩(wěn)定的實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）擴(kuò)增體系；王衛(wèi)國等[10]研究了微波和高壓對大豆轉(zhuǎn)基因成分的影響，結(jié)果表明微波處理的樣品核酸降解比較徹底。以上實(shí)驗(yàn)表明，初級的加工方式對核酸的影響不大。而壓榨、抽提等深加工方式對產(chǎn)品中核酸的保留程度有很大的影響，李允靜等[11]論述了植物油的轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)的研究進(jìn)展，針對植物油中核酸含量低、片段短的現(xiàn)狀，提出了縮短檢測靶標(biāo)開展食用植物油中轉(zhuǎn)基因成分檢測是今后研究的一個(gè)方向；核酸的質(zhì)量是整個(gè)PCR檢測的基礎(chǔ)，針對深加工產(chǎn)品，各個(gè)研究小組也提出了不同的前處理方法來獲取高質(zhì)量的DNA，SN/T 2705—2010《調(diào)味品中轉(zhuǎn)基因植物成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測方法》中對調(diào)味品的前處理采用了十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammoniumbromide，CTAB）處理和低溫差速離心的方法[12]，得到了可用于PCR檢測的DNA；程紅梅等[13]研制了離心柱法提取大豆油中DNA，可以從10mL油中提取出0.4μg DNA；欒鳳俠等[14]比較了CTAB方法及改良試劑盒方法在提取油脂中DNA的效果，推出了適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測的提取試劑盒。目前大豆油及調(diào)味品中的大豆轉(zhuǎn)基因成分的檢測做了較多的研究，劉錦鶴等[15]利用硅膜吸附柱法來富集提取大豆油中的DNA，PCR擴(kuò)增后能夠得到清晰的目的基因條帶，在7個(gè)樣品中檢出了外源基因；張娟等[16]以CTAB法為基礎(chǔ)進(jìn)行DNA提取方法的優(yōu)化，所建立的方法在樣品的檢測中可以有效檢出內(nèi)源基因；張文志等[17]設(shè)計(jì)了熒光定量PCR的探針來檢測醬油中外源基因，建立了逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription PCR，RT-PCR）的方法檢測大豆成分。

這些樣品的前處理方法較為成熟，在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中，制定單位可驗(yàn)證并采用這些研究成果，完善國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)，為食品轉(zhuǎn)基因檢測及監(jiān)督提供技術(shù)保障。

3 現(xiàn)行轉(zhuǎn)基因大豆的檢測及標(biāo)準(zhǔn)的概況

已經(jīng)有眾多學(xué)者利用酶聯(lián)免疫吸附法[18-19]、色譜法[20-21]、芯片法[22-24]、光譜法[25]、核酸檢測法[5-7]等開展大豆制品的轉(zhuǎn)基因成分檢測的研究，形成國家檢測標(biāo)準(zhǔn)且應(yīng)用廣泛的是核酸檢測方法，經(jīng)檢索，我國已發(fā)布大豆及其制品轉(zhuǎn)基因成分檢測的方法主要有農(nóng)業(yè)部公告16項(xiàng)，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)12項(xiàng)，農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)5項(xiàng)，轉(zhuǎn)基因檢測實(shí)驗(yàn)室通用的國家標(biāo)準(zhǔn)8項(xiàng)、農(nóng)業(yè)部公告1項(xiàng)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)1項(xiàng)，另外還有部分地方標(biāo)準(zhǔn)等。檢測標(biāo)準(zhǔn)中均為定性檢測，轉(zhuǎn)基因通用的國家標(biāo)準(zhǔn)中對實(shí)驗(yàn)室的布局、樣品的制備、核酸的提取和PCR體系、實(shí)驗(yàn)過程的質(zhì)量控制和結(jié)果的判斷表述都作了較為詳細(xì)的說明，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)和日常的檢測工作都應(yīng)遵循這些標(biāo)準(zhǔn)。各檢測方法都有其自身的適用范圍，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)檢測樣品及檢測環(huán)境條件進(jìn)行選擇實(shí)驗(yàn)，常用檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較見表1。

表1 常用檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 1 Comparison of the advantages and disadvantages of commonly used detection methods

檢測方法標(biāo)準(zhǔn)主要是農(nóng)業(yè)部的1485、1782、2031、2122、2259號公告及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)源基因選用了大豆凝集素Lectin基因，外源基因則是通過檢測耐除草劑、抗蟲和品質(zhì)改良的轉(zhuǎn)化體特異序列來判斷是否含有轉(zhuǎn)基因成分（如CaMV 35S啟動子、NOS終止子等），檢測步驟包括：抽樣及樣品制備、模板的制備純化、PCR反應(yīng)、產(chǎn)物檢測，對大豆的原料及初級加工產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因檢測來說是比較容易，且能取得很好的結(jié)果，這都源于模板DNA的獲得。植物油、調(diào)味品等由于其加工工藝的特殊性，核酸在加工過程中的降解、含量低等特點(diǎn)，使得DNA模板在提取過程中相當(dāng)困難[39-40]，其他的深加工產(chǎn)品如阿膠DNA的提取也存在類似的問題[41]，同時(shí)市場上也推出了相關(guān)的試劑盒產(chǎn)品（如EdibleVegetable Oil DNA Extraction Kit等），研究人員對傳統(tǒng)方法改進(jìn)后進(jìn)行DNA的提取[42]，獲得很好的效果。

大豆轉(zhuǎn)基因檢測的標(biāo)準(zhǔn)中核酸的擴(kuò)增檢測主要分為普通PCR、熒光定量PCR方法和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）3種方法。普通PCR在DNA聚合酶的作用下，通過引物與模板DNA的退火延伸，目標(biāo)片段得到指數(shù)擴(kuò)增，使用凝膠電泳對片段的大小進(jìn)行檢測，回收測序來判斷目標(biāo)序列，屬于定性反應(yīng)。熒光定量PCR則是在PCR的基礎(chǔ)上通過熒光探針或熒光染料的加入使得熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成同步，從而使目標(biāo)DNA的定量成為可能。

引物的設(shè)計(jì)是影響PCR實(shí)驗(yàn)的重要因素，尤其對DNA含量少、片段小的產(chǎn)品（如油脂類、調(diào)味品等），引物的長短、特異性都是關(guān)鍵點(diǎn)，熒光定量PCR在實(shí)驗(yàn)完畢后通過Ct值來判斷是否含有目標(biāo)基因，較普通PCR快速方便，是我國在標(biāo)準(zhǔn)或科研中使用最多的方法，該技術(shù)在探針的設(shè)計(jì)及檢測儀器比較昂貴。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、不需要特殊的儀器、操作簡單，同時(shí)引物設(shè)計(jì)和前期開發(fā)較復(fù)雜，容易造成假陽性，但環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)不需要PCR儀和昂貴的試劑，有著廣泛的應(yīng)用前景，容易在基層檢測機(jī)構(gòu)推廣，目前僅在原料的轉(zhuǎn)基因檢測方面有應(yīng)用[43]。

4 討論與建議

我國按照全球公認(rèn)的評價(jià)準(zhǔn)則并結(jié)合國情，建立了涵蓋1個(gè)國務(wù)院條例、5個(gè)部門規(guī)章的法律法規(guī)體系，覆蓋轉(zhuǎn)基因研究、試驗(yàn)、生產(chǎn)、加工、經(jīng)營、進(jìn)口許可審批和產(chǎn)品強(qiáng)制標(biāo)識等各環(huán)節(jié)，形成了一整套適合我國國情并與國際接軌的法律法規(guī)、技術(shù)規(guī)程和管理體系，為我國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因安全管理提供了有力保障。但在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域，大豆產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因檢測的標(biāo)準(zhǔn)較多，檢測基因不同，相互之間存在不統(tǒng)一，在這里提出幾個(gè)在實(shí)驗(yàn)過程中的問題，以期給現(xiàn)階段正在進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)整合工作提供一定的參考。

模板DNA濃度和純度：農(nóng)業(yè)部發(fā)布的轉(zhuǎn)基因大豆檢測公告（以下簡稱“公告”）中對于模板DNA的濃度都給出了明確的說明，即PCR反應(yīng)管中的終質(zhì)量濃度為2mg/L，在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中對DNA的濃度給定了一個(gè)范圍，在方法驗(yàn)證過程中需根據(jù)儀器的檢出限等特點(diǎn)自行實(shí)驗(yàn)。模板的濃度和純度對痕量目的基因的檢測來說是較為重要的，紫外分光光度計(jì)除給出濃度外，A260nm/A280nm的比值用于評估樣品的純度，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)對這兩點(diǎn)進(jìn)行關(guān)注，需要質(zhì)控樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。

循環(huán)次數(shù)：公告中PCR反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)統(tǒng)一為35次，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中為40次。PCR反應(yīng)體系中的酶和底物在最初的循環(huán)中，快速的結(jié)合擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)S型，循環(huán)次數(shù)過多，產(chǎn)物間可能會形成較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，模板的特異性降低，可能會形成非特異性擴(kuò)增，給后續(xù)的檢測帶來誤差，因此循環(huán)次數(shù)不是越多越好，如果Ct值為35～40，實(shí)驗(yàn)人員需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，生產(chǎn)加工過程中多個(gè)生產(chǎn)線上產(chǎn)品之間的交叉所帶來的痕量DNA對結(jié)果的判定存在干擾，標(biāo)準(zhǔn)制定應(yīng)對此明確。

PCR產(chǎn)物的檢測：定性PCR方法中，產(chǎn)物的檢測使用了瓊脂糖凝膠電泳來分離判斷片段大小，由于樣品中殘留的核酸片段小、含量少、擴(kuò)增效率不高，結(jié)果判定時(shí)比較依賴檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)。熒光定量PCR和毛細(xì)管凝膠電泳的引入在很大程度上可以彌補(bǔ)定性檢測的缺陷，但儀器價(jià)格昂貴，很難普遍推廣，特別是基層監(jiān)管機(jī)構(gòu)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的獲?。篏B/T 19595.2—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求》中要求檢驗(yàn)過程應(yīng)設(shè)置實(shí)驗(yàn)室環(huán)境對照、陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控和PCR抑制物對照來作為實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)基因檢測體系的質(zhì)量控制手段，陰性質(zhì)控包括核酸提取空白對照、PCR擴(kuò)增試劑對照和陰性目標(biāo)DNA對照，陽性質(zhì)控包括陽性提取對照、陽性目標(biāo)DNA對照和弱陽性目標(biāo)序列對照[31]，這里提到的陰性目標(biāo)DNA對照和陽性質(zhì)控都屬于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它的使用是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測結(jié)果有效的重要保證。按是否需要認(rèn)證分為基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、普通標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可以溯源到有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的是普通標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，正常使用和消耗的主要是工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。在正常監(jiān)管工作中轉(zhuǎn)基因生物定性檢測主要采用工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陰性和陽性對照，轉(zhuǎn)基因生物定量檢測可以采用普通標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有4種形態(tài)：種子、粉末、目標(biāo)DNA和質(zhì)粒，這4種形態(tài)各有優(yōu)劣，市場上能夠提供的品系種類有限，大部分實(shí)驗(yàn)室使用的是代代相傳的種子。目前農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心負(fù)責(zé)研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已經(jīng)面向市場提供，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的規(guī)范化生產(chǎn)和監(jiān)管體系的完善指日可待。

5 總結(jié)與展望

中國是轉(zhuǎn)基因生物及其制品的巨大市場，而豆制品又居于首位，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，除抗除草劑品種外，將會有更多的品種出現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品可以增加產(chǎn)量，解決食品短缺問題，還可以增加食品的種類，改進(jìn)食品的營養(yǎng)成分，增加作物的抗蟲害、耐嚴(yán)寒、抗高溫、耐鹽堿、抗倒伏的能力。同時(shí)也給轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管和檢測提出了更為嚴(yán)峻的問題。為適應(yīng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速發(fā)展，要構(gòu)建標(biāo)識和檢測標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)管體系，以統(tǒng)一、有效、協(xié)調(diào)、時(shí)效性為原則，開展對標(biāo)準(zhǔn)體系的評價(jià)、確認(rèn)和改進(jìn)，進(jìn)一步完善標(biāo)準(zhǔn)體系，為保障食品安全做好技術(shù)支撐。