地黃磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的克隆與空間表達(dá)

邵露營，周延清，楊 珂，郭萌萌

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007)

磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphateisomerase,TPI或TIM)被發(fā)現(xiàn)于植物、蟲類、真菌等幾乎全部的生物個(gè)體中，能夠催化磷酸二羥丙酮(DHAP)和D型3-磷酸甘油醛(GAP)，用于磷酸丙糖異構(gòu)體之間的可逆轉(zhuǎn)換[1]，在糖酵解和脂肪酸合成等途徑中具有非常重要的作用。目前，TPI基因在部分生物如玉米[2]、龍眼[3]、草菇[4]、松墨天牛[5]等中已相繼被克隆。研究表明，草菇TPI基因表現(xiàn)出異核體表達(dá)的協(xié)同增效作用；在克氏原螯蝦體內(nèi)TPI是一種新型過敏原，能夠引起機(jī)體的過敏反應(yīng)；通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，Salekdeh等[6]發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下水稻TPI基因的表達(dá)量顯著上升。地黃(Rehmanniaglutinosa)是“四大懷藥”之一,屬于玄參科地黃屬多年生草本植物,主要以塊根入藥，是一種重要的傳統(tǒng)中藥藥材。地黃種類繁多，一般分為鮮地黃、生地黃和熟地黃。其中，鮮地黃具有清熱生津、涼血止血功效，生地黃具有養(yǎng)陰生津的功效，而熟地黃具有滋陰補(bǔ)血、益精填髓的功效。目前，地黃中的一些基因已被報(bào)道，主要有地黃擴(kuò)展蛋白基因RgExpA1[7]、RgEXPA10[8]，纖維素合酶基因[9]，液泡質(zhì)子泵焦磷酸水解酶基因RgVP和3-酮酯酰CoA-硫解酶基因RghKAT、RglKAT[10]，與B12D基因同源的未知功能基因RghBNG[11]，酪氨酸脫羧酶基因[12]，牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶基因RgGGPPS1[13]、RgGGPPS2[14]，PR蛋白基因RGPR-10[15-16]，1-脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因RgDXR[17]，但尚未見RgTPI基因的克隆及空間表達(dá)研究。為此，基于已有的部分RgTPI基因片段，采用電子克隆的方法獲得絕大部分cDNA序列和全長開放閱讀框(ORF)序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)及空間表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究其在糖酵解過程中的作用及其他功能的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試地黃品種為溫85-5，其塊根種植于河南師范大學(xué)試驗(yàn)田。RgTPI基因380 bp片段由河南師范大學(xué)植物遺傳實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 絕大部分RgTPIcDNA及ORF全長序列的克隆 基于已有的380 bpRgTPI基因片段，利用在線NCBI中的Blast及DNAMAN軟件進(jìn)行一系列的同源比對(duì)、移除和拼接，最終獲得絕大部分的RgTPIcDNA序列。利用ORF finder獲得基因序列的ORF(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，最終得到RgTPI基因完整的ORF序列片段。

1.2.2RgTPI基因的生物信息學(xué)分析 利用軟件DNAMAN進(jìn)行RgTPI基因的同源性比對(duì)，采用軟件DNAstar中的Megalign繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用軟件Protparam分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，采用軟件SignalP 4.1 Server進(jìn)行信號(hào)肽分析[18]，采用軟件TMHMM Server v.2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，利用 NCBI的Conserved Domain Database數(shù)據(jù)庫分析保守結(jié)構(gòu)域，利用軟件Polarity/Grantham分析蛋白質(zhì)極性，利用軟件Expasy中的SOPMA預(yù)測蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、CPHmodels預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用在線軟件Cbs中的Protfun預(yù)測基因功能，利用在線軟件Cbs中的NetPhos 3.1 預(yù)測磷酸化位點(diǎn)，利用在線網(wǎng)址https://www.genscript.com/psort.html進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.2.3RgTPI基因的組織特異性表達(dá)分析 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測RgTPI基因在地黃根、莖、葉中的表達(dá)情況。RgTPI基因引物序列為F:5′-TCGGCGGCAACTGGAAATG-3′,R:5′-ATGAAAATCAGGTCGCAGAGAACTT-3′，引物序列合成于英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，產(chǎn)物長164 bp。以TIP41基因(引物F：TGGCTCAGAGTTGATGGAGTGCT，R：CTCTCCAGCAGCTTTCTCGGAGA)作為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)體系見表1。qRT-PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。采用2-ΔΔCt分析方法對(duì)RgTPI基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

表1 qRT-PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 RgTPI基因的克隆及序列分析

經(jīng)克隆獲得871 bp的部分RgTPI基因cDNA序列，其中，ORF為765 bp(86—850)，編碼的蛋白質(zhì)共有254個(gè)氨基酸殘基(圖1)。

運(yùn)用在線軟件NCBI及DNAMAN分別進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)分析(圖2)，RgTPI氨基酸序列與其他部分相似性植物物種的總同源性為 75.37%，這些物種包括芝麻(Sesamumindicum)、猴面花(Mimulusguttatus)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、大豆(Glycinemax)、大麥(Hordeumvulgare)、黃連(Coptisjaponica)、煙草(Nicotianatabacum)、蜈蚣草(Pterisvittata)、蕪菁(Brassicarapa)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)和稻(Oryzasativa)。其中，與地黃親緣關(guān)系最近的是芝麻和猴面花，同源性分別為98.43%和96.85%，與蛋白核小球藻的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，同源性僅為56.75%。

圖1 RgTPI基因的大部分cDNA序列及預(yù)測的編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列

圖2 RgTPI與近緣物種TPI蛋白的序列比對(duì)分析

基于TPI氨基酸序列的地黃及其近緣物種的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(圖3)與DNAMAN一致，與地黃親緣關(guān)系最近的是芝麻和猴面花，率先聚為一支，后與煙草、擬南芥和蕪菁聚在一起成為一支，與蛋白核小球藻的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。通過NCBI檢索得出，芝麻和猴面花的TPI基因的ORF大小也均為765 bp，間接說明本研究克隆的RgTPI基因ORF序列正確。

圖3 RgTPI的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2 RgTPI基因功能、結(jié)構(gòu)域預(yù)測

經(jīng)預(yù)測，RgTPI蛋白分子式是 C1228H1931N327O364S7，等電點(diǎn)(pI)是5.52，相對(duì)分子質(zhì)量為27 324.23，帶負(fù)電的氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為29個(gè)，帶正電的氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為25個(gè)，平均親水性系數(shù)為0.024，預(yù)測為親水性蛋白。 理論上推導(dǎo)其半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為24.12，屬于穩(wěn)定蛋白。該基因編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)中，纈氨酸(Val)所占的比例最多，為13.4%；其次為丙氨酸(Ala)，為10.2%。

經(jīng)特定匹配得出，RgTPI蛋白屬于ICL-KPHMT超家族，即是ICL-KPHMT超家族成員(圖4)。RgTPI基因主要存在于線粒體內(nèi)，還可能存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(表2)。對(duì)RgTPI蛋白的極性進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，RgTPI蛋白極有可能是親水性蛋白(圖5)，這與前面RgTPI蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測結(jié)果一致。軟件分析發(fā)現(xiàn)，RgTPI蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)目為0，即該蛋白沒有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，推測其極有可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的功能，這與亞細(xì)胞定位結(jié)果一致。

圖4 RgTPI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

表2 RgTPI基因亞細(xì)胞定位結(jié)果

圖5 RgTPI蛋白極性預(yù)測

由表3可知，RgTPI蛋白無信號(hào)肽，說明其不是分泌性蛋白，也表明其極有可能在細(xì)胞內(nèi)參加某些反應(yīng)。對(duì)RgTPI蛋白進(jìn)行功能預(yù)測(表4)發(fā)現(xiàn)，該蛋白是一種酶，且是轉(zhuǎn)移酶。

表3 RgTPI蛋白信號(hào)肽預(yù)測

表4 RgTPI蛋白功能預(yù)測

對(duì)RgTPI蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(圖6)發(fā)現(xiàn)，其磷酸化位點(diǎn)有14個(gè)絲氨酸(Ser)、12 個(gè)蘇氨酸(Thr)和5個(gè)酪氨酸(Tyr)。

圖6 RgTPI蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

2.3 RgTPI蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)多肽鏈折疊產(chǎn)生的由氫鍵維系的規(guī)則構(gòu)象[19]。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)在已有的二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步折疊的三維構(gòu)象形式。三級(jí)結(jié)構(gòu)主要依靠氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)之間的次級(jí)鍵來維持，一個(gè)特定蛋白質(zhì)的功能由蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象決定[20]。對(duì)RgTPI蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7)進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，RgTPI蛋白中α螺旋最多，占46.06%；其次是無規(guī)卷曲，占28.35%；延伸鏈占16.93%；β轉(zhuǎn)角占8.66%。

①代表α螺旋；②代表β轉(zhuǎn)角；③代表延伸鏈；④代表無規(guī)卷曲

2.4 RgTPI基因組織特異性表達(dá)分析

由圖8可知，RgTPI基因在地黃根、莖、葉中均表達(dá)，在葉中表達(dá)量最高，莖、根中微量表達(dá)，即表達(dá)量表現(xiàn)為葉>莖>根。

圖8 RgTPI基因在地黃不同器官的表達(dá)水平

3 結(jié)論與討論

本研究克隆所得RgTPI基因ORF長765 bp，編碼254個(gè)氨基酸殘基。經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，RgTPI蛋白為親水性蛋白；其半衰期為30 h，屬于穩(wěn)定蛋白；該蛋白屬于ICL-KPHMT超家族成員；該蛋白與芝麻、猴面花TPI蛋白的同源性較高，分別為98.43%、96.85%；該蛋白不含信號(hào)肽，說明其不能跨膜運(yùn)輸，不是分泌蛋白，極有可能在細(xì)胞內(nèi)參加某些反應(yīng)；RgTPI基因大多存在于線粒體中。RgTPI基因在地黃葉中表達(dá)量最高，莖、根中微量表達(dá)，推測該基因在地黃中尤其在葉的分化及發(fā)育過程中起重要作用。本研究針對(duì)地黃糖酵解過程中的RgTPI蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，填補(bǔ)了地黃基因庫的研究空缺，為進(jìn)一步加快探索RgTPI基因功能提供了一定的理論信息和科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步研究其在糖酵解過程中的作用及其他功能的開發(fā)應(yīng)用奠基了基礎(chǔ)。