激動核受體RXR對大鼠心肌細(xì)胞饑餓損傷中自噬和凋亡的雙重調(diào)控作用

單培仁 余靈芳 周昌鉆 朱千里 黃周青 陳晨

缺血性心臟病，尤其是急性心肌梗死，在全球有較高的發(fā)病率和病死率。雖然緊急再灌注治療可降低病死率，但梗死后心室重構(gòu)導(dǎo)致的心力衰竭仍是一個非常嚴(yán)重的問題。細(xì)胞自噬和凋亡發(fā)生貫穿于心肌梗死后的整個病理生理過程[1-2]。凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式，抑制凋亡可改善心肌梗死后的心臟功能[2]。自噬是細(xì)胞降解和回收細(xì)胞器和長壽蛋白的主要代謝途徑，在心肌細(xì)胞中自噬起著雙重作用，在不同的病理條件下表現(xiàn)出保護(hù)或有害作用，調(diào)控自噬已成為當(dāng)前心血管疾病治療的重要靶點[1-3]。

維甲類X受體（retinoid X receptor，RXR）是眾多核受體中的獨特一員，能與其它眾多細(xì)胞核受體發(fā)生交互作用，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等方面發(fā)揮重要功能[4-5]。我們前期的研究表明，激動核受體RXR可以保護(hù)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，但其機(jī)制還不是很明確，尤其是在自噬水平中的調(diào)控作用[6]。為此，我們采用大鼠心肌細(xì)胞株H9c2建立無糖無血清（serum and glucose deprivation,SGD）饑餓狀態(tài)損傷模型，用RXR激動劑9-順式維甲酸 （9-cis retinoid acid，c-RA）、RXR 拮抗劑HX531進(jìn)行干預(yù)，觀察激動核受體RXR對H9c2細(xì)胞SGD損傷的保護(hù)作用，探討其可能機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 無糖Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，美國 Gibco公司，批號：1930192，規(guī)格：500ml）、高糖 DMEM（美國 Gibco 公司，批號：8118168，規(guī)格：500ml）、FBS（美國 Gibco 公司，批號：1828728，規(guī)格：500ml）、c-RA（美國 Sigma 公司，批號：533-3-8，規(guī)格：10mg），JC-1試劑盒（美國 Molecular Probes公司，貨號：M34152，規(guī)格：1 kit），NucViewTM488 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3試劑盒（美國Biotium，Inc，批號：10402，規(guī)格：100μl），Western blot法檢測所用的兔多克隆抗Bax（美國Cell Signaling公司，批號：2772s，規(guī)格：100μl）、Bcl-2（美國 abcam 公司，批號：ab59348，規(guī)格：100μg）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-9（美國 Cell Signaling公司，批號：20750，規(guī)格：100μl）及 β-肌動蛋白抗體（美國 Cell Signaling 公司，批號：4970，規(guī)格：100μl），HX531 由日本東京大學(xué)Dr.Hiroyuki Kagech贈送。

1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng) 將大鼠心肌細(xì)胞株H9c2（購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心）用含10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長密度達(dá)90%時予以3∶1傳代。

1.3 細(xì)胞分組及培養(yǎng) 將傳代接種于培養(yǎng)板生長24h的細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組并按以下方法干預(yù)：（1）對照組（C組）：10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基中加入0.1%的二甲基亞砜培養(yǎng)6h；（2）SGD組：無糖DMEM中培養(yǎng)6h；（3）RA組：向培養(yǎng)液中加入終濃度為100nmol/L c-RA預(yù)處理1h后，在無糖DMEM中培養(yǎng)6h；（4）HX組：向培養(yǎng)液中加入終濃度2.5μmol/L HX531預(yù)處理0.5h，再加入終濃度為100nmol/L c-RA處理1h后，在無糖DMEM中培養(yǎng)6h。干預(yù)后采用透射電鏡檢測心肌細(xì)胞自噬小體。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞活力 用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔200μl，各實驗組的藥物處理后，每孔加入5mg/ml MTT試劑20μl，37℃孵育4h，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜 200μl，37℃孵育 20min，用酶標(biāo)儀 Elx800 microplate reader（美國BioTek）在波長570nm下檢測光密度（空白對照為不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液，空白孔調(diào)零）。

1.5 JC-1流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡百分比及Caspase-3活力 根據(jù)細(xì)胞熒光顏色和強(qiáng)度不同判斷凋亡細(xì)胞，計數(shù)10 000個細(xì)胞后，以凋亡細(xì)胞數(shù)除以10 000作為細(xì)胞凋亡百分比。收集各組細(xì)胞，加入5μg/ml JC-1探針 37°C孵育30min，溫PBS洗1次，上流式細(xì)胞儀（FACS Calibur,美國BD公司）檢測細(xì)胞凋亡百分比（激發(fā)光488 nm，散發(fā)光 530nm 和 585nm）[6-7]。Caspase-3活化是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志，本研究采用流式法測量平均熒光強(qiáng)度（MFI）來反映Caspase-3活力。以1×105/孔細(xì)胞密度接種于6孔板中，在各組處理后，用胰酶消化，PBS重懸，加入2μmol/L NucView 488 Caspase-3底物避光孵育15min，PBS洗1次，上流式細(xì)胞儀檢測（激發(fā)光488nm，散發(fā)光530nm），求得MFI，以C組所測的MFI為1，其余孔測得的MFI與其比值來表示Caspase-3活力。

1.6 Western blot法檢測蛋白表達(dá) 包括凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及下游活性片段Caspase-9蛋白表達(dá)，以及自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin 1表達(dá)。收集經(jīng)試驗處理的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，4℃搖床上裂解20min，在4℃下以12 000r/min離心15min，收集上清液即為全細(xì)胞裂解液。用BCA法定量蛋白，取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育等步驟后，用免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑孵育后，X線膠片曝光，曝光顯影的目的條帶用Image J處理軟件進(jìn)行半定量分析，以內(nèi)參為參考標(biāo)準(zhǔn)計算出目的條帶標(biāo)準(zhǔn)化后的光密度值，并以此判斷蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SAS 6.12統(tǒng)計軟件，測得計量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組心肌細(xì)胞活力的比較 見圖1。

圖1 4組心肌細(xì)胞活力的比較（與C組比較，*P＜0.01；與SGD組比較，△P＜0.01）

由圖1可見，與C組比較，SGD組和HX組心肌細(xì)胞活力均下降（均P＜0.01）；與SGD組比較，RA組心肌細(xì)胞活力上升（P＜0.01）。

2.2 4組心肌細(xì)胞凋亡百分比比較 見圖2。

由圖2可見，與C組比較，SGD組和HX組心肌細(xì)胞凋亡百分比均上升（均P＜0.01）；與SGD組比較，RA組心肌細(xì)胞凋亡百分比明顯下降（P＜0.01）。

2.3 4組心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白水平比較 見圖3。

圖2 4組心肌細(xì)胞凋亡百分比比較（a：JC-1結(jié)合流式細(xì)胞法測量細(xì)胞凋亡百分比，右下象限表示凋亡細(xì)胞；b：各組凋亡百分比條狀圖；與 C 組比較，*P＜0.01；與 SGD 組比較，△P＜0.01）

圖 3 4組心肌細(xì)胞 Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白水平比較（a：Westernblot法檢測Bcl-2、Bax及活性片段Caspase-9蛋白表達(dá)電泳圖；b：半定量分析各蛋白表達(dá)條狀圖，設(shè)C組Bax/Bcl-2、Caspase-9表達(dá)為1，與C 組比較，*P＜0.01，與SGD 組比較，△P＜0.01）

由圖3可見，SGD干預(yù)可誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，引起B(yǎng)ax/Bcl-2比值上升，并伴有Caspase-9蛋白水平增高。與C組比較，SGD組和HX組心肌細(xì)胞Bax/Bcl-2比值和Caspase-9蛋白水平均上升（均P＜0.01）；與SGD組比較，RA組心肌細(xì)胞Bax/Bcl-2比值和Caspase-9蛋白水平明顯下降（均P＜0.01）。

2.4 4組Caspase-3活力比較 見圖4。

圖4 4組Caspase-3活力比較（a：波峰右移表示熒光增強(qiáng)，反映Caspase-3活力增高；b：各組Caspase-3活力條狀圖，以各組與C組M FI的比值表示，與對照組比較，*P＜0.01，與SGD組比較，△P＜0.01）

由圖4可見，SGD組MFI值波峰明顯右移，MFI值為C組的2.3倍（P＜0.01）；而RA組波峰出現(xiàn)明顯左移，MFI值僅為C組的1.3倍，明顯低于SGD組（P＜0.01）；HX組波峰與SGD組相似，MFI值顯著高于C組（P＜0.01）。

2.5 4組間自噬水平及相關(guān)蛋白水平的比較 見圖5。

圖5 4組自噬水平及相關(guān)蛋白水平的比較（a：透射電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體；b：W est ern bl ot法檢測Becl i n 1及LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)電泳圖；c：半定量分析各蛋白表達(dá)條狀圖，設(shè)C組Becl i n 1及LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)為 1，與C組比較，*P＜0.01，與SGD組比較，△P＜0.01）

由圖5可見，C組中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器完整，而SGD組和HX組自噬小體數(shù)增加，其內(nèi)含有被吞噬的線粒體等結(jié)構(gòu)，部分呈空泡樣改變，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ比值上升，Beclin 1表達(dá)增加（均P＜0.01）；RA組心肌細(xì)胞自噬小體數(shù)量明顯減少，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值下調(diào)，Beclin 1蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.01）。

3 討論

盡管自噬的概念早在幾十年前就已形成，但它在病理過程中的確切作用仍不清楚。心肌細(xì)胞是不可再生的終末分化細(xì)胞，自噬在穩(wěn)定心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，維持正常的心臟結(jié)構(gòu)和功能中起著非常重要的作用[1-3]。

本研究中建立了心肌細(xì)胞饑餓模型，結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡和自噬水平均明顯升高，這與既往的文獻(xiàn)報道一致[8-9]。心肌細(xì)胞營養(yǎng)缺乏是一種常見的臨床事件，它介導(dǎo)各種心臟缺血過程，如冠心病和心力衰竭。為了應(yīng)對饑餓，自噬上調(diào)，雙膜自噬體將損害的細(xì)胞器或部分細(xì)胞質(zhì)隔離，并與溶酶體融合水解酶，為能量生成提供了內(nèi)在的營養(yǎng)來源，從而促進(jìn)生存[8-9]。

我們發(fā)現(xiàn)，激動RXR能明顯抑制饑餓狀態(tài)下的凋亡水平，其與抑制線粒體凋亡通路相關(guān)。早期就有研究顯示RXRα突變胎鼠在心肌能量代謝上存在明顯異常，超微結(jié)構(gòu)顯示線粒體數(shù)量增多，但ATP含量卻明顯減少，說明RXRα在維持心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能中存在重要作用。而線粒體是細(xì)胞中維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定非常重要的細(xì)胞器[10]。所以我們認(rèn)為，c-RA在激動RXR后，穩(wěn)定了線粒體膜電位，穩(wěn)定了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，減少外源性有害物質(zhì)刺激誘發(fā)凋亡作用。這與既往的研究類似[6]，但RXR受體在心肌細(xì)胞中的自噬調(diào)控作用尚不清楚。

在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)激動RXR能抑制自噬水平，增加心肌細(xì)胞活力。這也間接說明了在當(dāng)前的饑餓狀態(tài)模型下，自噬是有害的，這與我們前期的研究類似：在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中自噬起到致命性作用，抑制自噬可保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，而增強(qiáng)自噬將惡化心肌損傷[7]。既往對自噬的功能意義一直存在諸多爭議，比如即使在相同的病理條件下（如饑餓），自噬既能發(fā)揮促生存作用，又存在導(dǎo)致死亡的風(fēng)險。因此，目前認(rèn)為自噬的程度似乎是決定它將發(fā)揮保護(hù)或有害作用的關(guān)鍵[11]。

自噬和凋亡在饑餓反應(yīng)中同時發(fā)生，兩者間的相互作用是決定程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵[12]。但它們間相互作用的確切機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為Beclin1和Bcl-2家族不僅是自噬和凋亡信號通路發(fā)生交互作用的靶點，而且也可能是平衡自噬強(qiáng)度的潛在靶點，自噬現(xiàn)象究竟是誘導(dǎo)細(xì)胞存活還是死亡可能取決于Bcl-2與Beclin1之間的平衡[12-14]。Bcl-2是抗凋亡蛋白中重要成員，在線粒體外膜發(fā)揮作用，以維持膜的完整性。Beclin 1能與Bcl-2發(fā)生相互作用，被認(rèn)為是自噬的重要調(diào)控因子。Beclin 1與Bcl-2家族的抗凋亡多域蛋白相互作用，尤其是Bcl-2及其同源物Bcl-X（L），其BH3域為同時具有親水和疏水部分的α螺旋，與Bcl-2/Bcl-X（L）的疏水性裂隙結(jié)合[15]。研究表明，Bcl-2與Beclin1的相互作用通過干擾自噬啟動子復(fù)合物Beclin1/hVps34的形成和活性，導(dǎo)致自噬的抑制。本研究發(fā)現(xiàn)激動RXR能上調(diào)Bcl-2蛋白，同時下調(diào)Beclin 1蛋白，這說明RXR可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Beclin1蛋白表達(dá)，而發(fā)揮抗凋亡和抗自噬作用，但具體的上游通路還有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究證明了激動RXR在饑餓狀態(tài)下抑制心肌細(xì)胞凋亡和自噬的發(fā)生，可保護(hù)心肌細(xì)胞在饑餓狀態(tài)下的生存。