高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析毛發(fā)中甲基苯丙胺和苯丙胺手性對(duì)映異構(gòu)體

張穎怡, 李 良, 邢旭琴, 周政政, 馬安德*

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫系, 廣東 廣州 510515; 2. 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系, 廣東 廣州 510080)

甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)屬于苯丙胺(amphetamine, AM)類興奮劑,其鹽酸鹽又名“冰毒”,有著強(qiáng)烈的致幻作用及成癮性,是我國(guó)管制類精神物質(zhì)。從化學(xué)結(jié)構(gòu)看(見圖1), METH等苯丙胺類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)不對(duì)稱的手性中心[1],具有兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體,分別為S-(+)-METH和R-(-)-METH,其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用、毒性及代謝機(jī)制均有較大差異[2],S-(+)-METH是“冰毒”的主要成分,而R-(-)-METH多用于醫(yī)療[3]。(±)-METH即為等物質(zhì)的量的S-(+)-METH和R-(-)-METH混合而成。同時(shí),AM作為METH的代謝產(chǎn)物,常與METH同時(shí)出現(xiàn),因此對(duì)于METH和AM手性對(duì)映異構(gòu)體的區(qū)分顯得尤為重要。

圖 1 甲基苯丙胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

隨著新型毒品的合成方式及原料獲取趨于簡(jiǎn)單,METH的濫用現(xiàn)象仍不斷出現(xiàn)。METH可以在多種生物檢材中被檢出,如尿液及血液,但這兩種生物檢材的檢測(cè)窗口期較短,并存在易污染、難以采集與保存的弊端[4,5]。毛發(fā)作為一個(gè)穩(wěn)定、易采集與保存的生物樣本,其檢測(cè)窗口期可以顯著延長(zhǎng),同時(shí)可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定保存毒品信息。因此,毛發(fā)中毒品的檢測(cè)也可以作為認(rèn)定吸毒成癮的依據(jù)[6,7],但毛發(fā)作為固體介質(zhì),提取方法不同于血液、尿液等生物檢材[8-13]。目前已有對(duì)METH對(duì)映異構(gòu)體的研究報(bào)道[14-17]。早期,METH對(duì)映異構(gòu)體的分離主要依靠衍生化[16,17],但該法耗時(shí)較長(zhǎng)且較為復(fù)雜,而采用直接法,利用手性固定相則可以簡(jiǎn)化前處理過程[18,19]。Wang等[15]利用手性固定相與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)對(duì)毛發(fā)中METH和AM進(jìn)行了分析,但未對(duì)毛發(fā)前處理方法進(jìn)行深入探討。

本實(shí)驗(yàn)考察了不同前處理方法對(duì)毛發(fā)中甲基苯丙胺與苯丙胺對(duì)映異構(gòu)體回收率的影響,并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了HPLC-MS/MS方法,最終用于實(shí)際司法鑒定案例的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20AD XR高效液相色譜儀(日本島津公司); API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)。

S-(+)-AM、R-(-)-AM、(±)-AM、S-(+)-METH、R-(-)-METH、(±)-METH(1 mg/mL,溶于甲醇溶液,美國(guó)Cerilliant公司);鹽酸普羅地芬(proadifen hydrochloride,純度>95%)、乙酸銨(色譜純)(美國(guó)Aladdin公司); 4-苯基丁胺(純度98%,日本TCI公司);甲醇(色譜純,美國(guó)Merck公司);甲酸(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);鹽酸、乙醚、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(廣州化學(xué)試劑廠)。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水儀(美國(guó)Millipore公司)制備。所有流動(dòng)相均用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2 溶液的配制

各取1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇稀釋,配制1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃冰箱保存;臨用時(shí)用甲醇稀釋,配制合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液;用甲醇將(±)-METH和(±)-AM標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在制作空白毛發(fā)加標(biāo)樣本時(shí)作為加標(biāo)溶液使用。

1.3 毛發(fā)的清洗及研磨

采用二氯甲烷、水、丙酮各約50 mL對(duì)毛發(fā)樣品依次振蕩清洗一次,于室溫下晾干,然后采用2.5 mm鋼珠與毛發(fā)高速渦旋研磨,最后將毛發(fā)分成每份約20 mg,待檢。

1.4 樣品前處理

1.4.1酸水解法

取約20 mg經(jīng)1.3節(jié)處理過的毛發(fā),加入1 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液(pH 1.0)或磷酸緩沖液(pH 5.0),于55 ℃水浴水解12 h,加入鹽酸水解12 h后,需用10%(v/v)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值,使其大于11。水解液用3 mL乙醚提取,渦旋1 min,以13 000 r/min離心10 min,取有機(jī)層,于60 ℃水浴揮干,殘余物中加入200 μL甲醇復(fù)溶,取5 μL進(jìn)樣分析。

1.4.2堿水解法

取約20 mg經(jīng)1.3節(jié)處理過的毛發(fā),加入1 mL 100 g/kg氫氧化鈉溶液,于80 ℃水浴水解5 min(或60 ℃水浴水解10 min);或加入1 mL 50 g/kg氫氧化鈉溶液,于70 ℃水浴水解20 min。水解液用3 mL乙醚提取,其他操作同1.4.1節(jié)。

1.4.3甲醇高溫水浴超聲法

取約20 mg經(jīng)1.3節(jié)處理過的毛發(fā),加入1 mL甲醇,于70 ℃水浴超聲30 min,以13 000 r/min離心10 min,用0.22 μm微孔濾膜過濾,氮?dú)獯蹈?殘余物中加入200 μL甲醇復(fù)溶,取5 μL進(jìn)樣分析。

1.5 空白毛發(fā)的加標(biāo)方式

實(shí)驗(yàn)采用未吸毒人員的毛發(fā)作為空白毛發(fā)。將配制好的500 ng/mL (±)-METH和(±)-AM混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接加入研磨后的毛發(fā)樣品中,混勻平衡48 h后,氮?dú)獯蹈?再進(jìn)行前處理。最終加標(biāo)毛發(fā)樣品的加標(biāo)量為100 ng/mg。

1.6 分析條件

色譜柱為SUPELCO Astec CHIROBIOTIC?V2手性液相色譜柱(250 mm×2.1 mm, 5 μm);柱溫為25 ℃;流動(dòng)相為甲醇-含0.1%(v/v)甲酸的20 mmol/L乙酸銨水溶液(99∶1, v/v);流速為0.4 mL/min;進(jìn)樣量為5 μL。

離子源為電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;檢測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;離子源溫度為600 ℃;電噴霧電壓為5 500 V;輔助氣1(gas 1)和輔助氣2(gas 2)壓力為379 kPa和448 kPa。目標(biāo)化合物的具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)初始使用DAICEL CHIRALPAK?IA-3手性色譜柱,發(fā)現(xiàn)該色譜柱對(duì)苯丙胺類對(duì)映異構(gòu)體選擇性較差,無法實(shí)現(xiàn)分離。然后采用SUPELCO Astec CHIROBIOTIC?V2手性色譜柱,該色譜柱的填料含有萬古霉素,對(duì)胺類化合物立體選擇性較好,故選為實(shí)驗(yàn)所用。

表 1 S-(+)-AM、R-(-)-AM、S-(+)-METH、R-(-)-METH的 保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

DP: declustering potential; CE: collision energy; * quantitative ion.

本實(shí)驗(yàn)考察采用不同有機(jī)相和水相時(shí)目標(biāo)化合物的分離效果(見圖2)。使用乙腈作為有機(jī)相、含0.2%(v/v)冰醋酸的0.05%(v/v)氨水作為水相時(shí),METH和AM的手性對(duì)映異構(gòu)體始終無法分離(顯示為單峰),而將有機(jī)相更換為甲醇時(shí),METH與AM的手性對(duì)映異構(gòu)體可實(shí)現(xiàn)初步分離,且甲醇對(duì)目標(biāo)化合物具有更好的分離選擇性,因此將甲醇確定為有機(jī)相。開始使用一元流動(dòng)相,向甲醇內(nèi)添加不同的酸、堿溶液,并嘗試改變甲醇內(nèi)添加劑的類型和比例,但均未能獲得較好分離。然后改用二元流動(dòng)相進(jìn)行分離,并比較了0.05%(v/v)氨水(含0.2%(v/v)冰醋酸)與20 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)作為水相時(shí)的分離效果,發(fā)現(xiàn)使用后者時(shí)METH與AM的手性對(duì)映異構(gòu)體分離效果較為穩(wěn)定(分離度分別為1.52和1.61),峰形較好,響應(yīng)高,而在前面兩種流動(dòng)相下,METH和AM的手性對(duì)映異構(gòu)體分離不穩(wěn)定且峰形較差(分離度分別為0.98和1.12)。

確定了有機(jī)相與水相后,對(duì)兩相的比例進(jìn)行了考察。研究發(fā)現(xiàn),隨著水相比例的提高,出峰時(shí)間逐漸縮短,但分離效果變差,因此實(shí)驗(yàn)最終確定有機(jī)相和水相的體積比為99∶1。該方法在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)METH和AM對(duì)映異構(gòu)體的手性分離。

圖 2 采用不同流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)化合物的總離子色譜圖

圖 3 不同內(nèi)標(biāo)與(±)-METH(100 μg/L)的總離子色譜圖

2.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了4-苯基丁胺和鹽酸普羅地芬兩種物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)時(shí)的效果(見圖3)。4-苯基丁胺常作為研究苯丙胺類物質(zhì)時(shí)的內(nèi)標(biāo),但在本實(shí)驗(yàn)條件下4-苯基丁胺的峰形不佳,且因其離子對(duì)(m/z150.1/91.0)與甲基苯丙胺的離子對(duì)(m/z150.1/91.1)互相影響,在該條件下色譜圖出現(xiàn)了多重峰,為4-苯基丁胺與(±)-甲基苯丙胺合并的峰(見圖3a),且經(jīng)多次調(diào)整仍無法分離,并不適合本方法。

實(shí)驗(yàn)考察的鹽酸普羅地芬常作為毒藥物研究時(shí)的內(nèi)標(biāo),由圖3b可知,鹽酸普羅地芬在該條件下峰形良好,始終能夠保持尖銳的峰,保留時(shí)間穩(wěn)定,且與甲基苯丙胺一同考察時(shí)可實(shí)現(xiàn)分離,因此本實(shí)驗(yàn)選用鹽酸普羅地芬作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

圖 4 不同提取方法下(±)-METH、(±)-AM和內(nèi)標(biāo)的總離子流色譜圖

2.3 提取方法的考察

苯丙胺類物質(zhì)可通過多種途徑進(jìn)入毛發(fā)。因此,為能夠最大限度地提取毛發(fā)中的毒物,同時(shí)減少損耗并不破壞對(duì)映異構(gòu)體的結(jié)構(gòu),提取方法顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用酸水解、堿水解及甲醇高溫水浴超聲法對(duì)加標(biāo)樣品中不同構(gòu)型的化合物進(jìn)行定量,并通過計(jì)算加標(biāo)回收率和考察對(duì)映異構(gòu)體的峰形衡量不同前處理方法的優(yōu)劣。

由圖4可知,鹽酸普羅地芬和AM在各提取方法中峰形相對(duì)穩(wěn)定,但是METH受提取方法的影響較大。其中,采用酸水解法和甲醇高溫水浴超聲法時(shí)(±)-甲基苯丙胺的峰形較好,拖尾因子>0.95。然而,在進(jìn)行堿水解后,(±)-甲基苯丙胺的峰形較差,與其他方法差異較大,可能原因是在該條件下METH手性結(jié)構(gòu)被破壞;部分已與水解液發(fā)生反應(yīng)或在水解過程中被消解。

實(shí)驗(yàn)采用的空白毛發(fā)為未吸毒人員的毛發(fā),無背景值(低于檢出限)。由圖5可知,采用甲醇高溫水浴超聲法時(shí)(±)-甲基苯丙胺和(±)-苯丙胺的加標(biāo)回收率最好,該法也是耗時(shí)最短、操作最為便捷的提取方法。實(shí)驗(yàn)還對(duì)比了常溫超聲與高溫超聲提取的提取效果。結(jié)果表明,如要達(dá)到相同的提取率,常溫提取至少需要超聲1 h,耗時(shí)較長(zhǎng),效率較低。隨著超聲溫度的升高,提取效率也得到提高,但當(dāng)水浴溫度超過70 ℃或者溫度大于50 ℃、超聲時(shí)間超過30 min,甲醇會(huì)較快發(fā)生沸騰,且較為劇烈,并發(fā)生溢出現(xiàn)象,因此水浴溫度設(shè)為70 ℃。

圖 5 不同提取方法下目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)

對(duì)加標(biāo)的空白毛發(fā)進(jìn)行分析,以苯丙胺類化合物的峰面積(y)對(duì)其含量(x, ng/mg)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果表明,4種物質(zhì)在15～300 ng/mg線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見表2)。

表 2 目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限和定量限

y: peak area;x: content, ng/mg.

本方法對(duì)信噪比(S/N)進(jìn)行計(jì)算得出檢出限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)。結(jié)果表明,R-(-)-甲基苯丙胺、S-(+)-甲基苯丙胺的LOD為0.1 ng/mg,R-(-)-苯丙胺和S-(+)-苯丙胺的LOD為0.15 ng/mg;R-(-)-甲基苯丙胺、S-(+)-甲基苯丙胺的LOQ為0.4 ng/mg,R-(-)-苯丙胺和S-(+)-苯丙胺的LOQ為0.5 ng/mg,滿足檢測(cè)需要。

2.4.2精密度

為保證數(shù)據(jù)的可靠性,配制低、中、高3個(gè)水平(20、100、250 ng/mg)的質(zhì)量控制(QC)樣品,每個(gè)水平進(jìn)行6次平行樣本分析,根據(jù)當(dāng)批的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算QC樣品的含量。結(jié)果表明,各化合物含量的日內(nèi)精密度≤6.8%,日間精密度≤11.4%(見表3)。

表 3 4種目標(biāo)化合物的日內(nèi)和日間精密度(n=6)

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)50余例甲基苯丙胺濫用者的毛發(fā)進(jìn)行了編號(hào)及檢測(cè),其中有35例(70%)同時(shí)檢出單一的S-(+)-甲基苯丙胺和S-(+)-苯丙胺,其中1號(hào)(No.1)樣品的檢測(cè)結(jié)果見圖6a。剩余15例同時(shí)檢出了S-(+)-甲基苯丙胺、S-(+)-苯丙胺和R-(-)-甲基苯丙胺,其中9例(18%)同時(shí)檢出了S-(+)-苯丙胺和R-(-)-苯丙胺,但均以S構(gòu)型為主(見表4),其中26號(hào)(No.26)樣品的總離子色譜圖見圖6b。

收集的50例陽性樣本均確診為甲基苯丙胺濫用者,且毛發(fā)作為能夠長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定保存其內(nèi)在毒物的生物檢材,所提供的生物信息反映的時(shí)間跨度更長(zhǎng)。其中,AM作為METH的代謝產(chǎn)物,與METH同時(shí)檢出,構(gòu)型一致,說明該法檢測(cè)靈敏準(zhǔn)確。而其中同時(shí)檢出兩個(gè)構(gòu)型METH的樣本,檢出相應(yīng)構(gòu)型AM的占18%,這也與代謝規(guī)律一致。而15例中未檢出R-(-)-苯丙胺的樣本,考慮其R構(gòu)型在代謝和檢測(cè)時(shí)可能存在損失或含量低于檢出限。由此可見,濫用者吸食“冰毒”的主要構(gòu)型仍為S-(+)-甲基苯丙胺,這一點(diǎn)也與相關(guān)報(bào)道[3,15]一致。同時(shí),這個(gè)結(jié)果也為打擊制毒犯罪提供更明確的方向。

圖 6 (a)1號(hào)和(b)26號(hào)陽性樣本的總離子色譜圖

表 4 15例檢出S-(+)-METH和R-(-)-METH的陽性樣本中各構(gòu)型的比例

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3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同提取方法對(duì)毛發(fā)中METH及AM手性對(duì)映異構(gòu)體的影響,同時(shí)對(duì)HPLC-MS/MS條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了METH和AM對(duì)映異構(gòu)體的手性分離方法。該法具有簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)、效率高與靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。通過應(yīng)用于司法鑒定實(shí)際案例,說明該法在實(shí)際應(yīng)用中具備可行性,并確定了濫用者吸食METH的主體構(gòu)型,為法醫(yī)毒物鑒定提供技術(shù)支持,同時(shí)也為毒物對(duì)映異構(gòu)體手性分離、毒物管制等方面給予一定參考。