加速溶劑萃取-固相萃取凈化-氣相色譜-串聯(lián)質譜法檢測茶葉中9種擬除蟲菊酯類農藥殘留

黃 微, 李 娜, 徐瑞晗, 李 婷, 李崇勇

(1. 漢中市食品藥品檢驗檢測中心, 陜西 漢中 723000; 2. 漢中市動物衛(wèi)生監(jiān)督所, 陜西 漢中 723000)

茶葉是我國的傳統(tǒng)飲品,不僅風味獨特,而且具有抗氧化、降壓降脂、防癌抗癌等保健功能[1-3],深受大眾喜愛。在茶葉的種植過程中,為防治蟲害,農藥的使用難以避免。如果農藥使用不規(guī)范,或者未到安全間隔期而進行茶葉采摘,往往會導致農藥殘留量超標。除此之外,大氣、土壤、水體等外源性污染亦是引起農藥殘留超標的重要原因[4]。農藥殘留超標不僅危害人體健康,也影響著我國茶葉在國際市場的競爭力,目前已經成為當前茶葉出口和內銷最被關注和最為敏感的質量安全問題。

擬除蟲菊酯類農藥是一類高效、低毒、廣譜的殺蟲劑[4],相比于有機氯、有機磷類農藥,其生物活性更優(yōu)異、環(huán)境相容性更好,因此被廣泛用于茶葉的種植和生產中。然而,由于擬除蟲菊酯類農藥對光、熱較為穩(wěn)定,其在自然環(huán)境下降解較慢,往往更容易導致殘留問題。殘留的擬除蟲菊酯類農藥對機體危害較大[5-7],目前國內外對于茶葉中的擬除蟲菊酯類農藥殘留均有嚴格的限量規(guī)定。我國國家標準GB 2763-2016《食品中農藥最大殘留限量》對茶葉中的氟氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯等9種擬除蟲菊酯類農藥殘留量做出了明確規(guī)定,殘留量為0.1～20 mg/kg。

我國現行方法標準中對茶葉擬除蟲菊酯類農藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜(GC)法[8]和氣相色譜-質譜(GC-MS)法[9]。由于茶葉基質比較復雜,易對目標組分造成干擾,采用氣相色譜法容易導致假陽性的誤判。氣相色譜-質譜法雖然能夠準確定性,但檢出限和靈敏度不夠理想。氣相色譜-串聯(lián)質譜(GC-MS/MS)法是近幾年來應用日益廣泛的一種農藥殘留檢測方法,它分離性能高,比單四極桿質譜有更強的抗干擾能力和更高的靈敏度。劉麗等[10]用乙腈超聲提取、串聯(lián)雙柱固相萃取凈化,用氣相色譜-串聯(lián)質譜檢測茶葉中的3種擬除蟲菊酯類農藥殘留,得到的檢出限為0.3～1.0 μg/kg,加標回收率為80.6%～116.3%, RSD為1.3%～12.6%。高藝美等[11]用乙腈提取、固相萃取柱凈化,雙內標法定量,氣相色譜-串聯(lián)質譜分析茶葉中的53種農藥殘留,得到的檢出限為0.3～8.9 μg/kg,加標回收率為72.5%～130.9%, RSD為0.4%～19.4%。以上文獻均顯示出了用氣相色譜-串聯(lián)質譜法測定農藥殘留的高靈敏性。

加速溶劑萃取是近年來新興的一種萃取技術,具有萃取時間短、溶劑消耗少、自動化程度高等優(yōu)點,被廣泛用于環(huán)境、食品中農藥殘留的檢測[12]。然而,目前加速溶劑萃取聯(lián)合氣相色譜-串聯(lián)質譜技術應用于檢測茶葉中擬除蟲菊酯類農藥殘留的研究尚未有相關報道。本文針對GB 2763-2016《食品中農藥最大殘留限量》中對茶葉做出限量規(guī)定的9種擬除蟲菊酯類農藥殘留檢測項目,利用加速溶劑萃取茶葉樣品,經固相萃取柱凈化,采用氣相色譜-串聯(lián)質譜法進行測定。所建立的方法快速簡便、抗干擾能力強、檢出限低、靈敏度高,實現了茶葉中擬除蟲菊酯類農藥殘留的痕量分析,完全能夠滿足我國對茶葉農藥殘留檢測的需求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

GCMS-TQ8040三重四極桿質譜儀、SH-RXi-5Sil MS色譜柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)(日本Shimadzu公司); APLE-2000快速溶劑萃取儀(北京吉天儀器有限公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司); IKA-RV10真空濃縮儀(德國IKA公司); MS1003S電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

氟氯氰菊酯(CAS: 68359-37-5)、氟氰戊菊酯(CAS: 70124-77-5)、甲氰菊酯(CAS: 64257-84-7)、聯(lián)苯菊酯(CAS: 82657-04-3)、氯氟氰菊酯(CAS: 68085-85-8)、氯菊酯(CAS: 52645-53-1)、氯氰菊酯(CAS: 52315-07-8)、氰戊菊酯(CAS: 51630-58-1)、溴氰菊酯(CAS: 52918-63-5)標準品(質量濃度均為100 mg/L,農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所);乙腈(色譜純,美國Sigma-Aldrich公司);乙酸乙酯(色譜純,美國Mreda公司);正己烷、丙酮(色譜純,美國Fisher Scientific公司);無水硫酸鈉(分析純,成都科龍化工試劑廠);硅藻土(分析純,天津鼎盛鑫化工有限公司); Cleanert TPT固相萃取小柱(2 g/10 mL,天津博納艾杰爾科技有限公司)。茶葉樣品為日常送檢樣品。

1.2 標準溶液的配制

混合標準工作液的配制:將9種擬除蟲菊酯類農藥標準品(100 mg/L)用正己烷分別配制成10 mg/L的單標儲備液,于4 ℃低溫避光保存。分別移取上述9種農藥單標儲備液1 mL,置于同一10 mL容量瓶中,用正己烷定容至刻度,配制成1 mg/L的混合標準使用液,用正己烷逐級配制成質量濃度分別為2、5、10、20、40、100、400和1 000 μg/L的混合標準工作液,現用現配。

基質匹配標準工作液的配制:稱取8份5 g空白茶葉,經加速溶劑萃取、固相萃取凈化、濃縮至近干后,分別加入2 mL不同濃度的混合標準工作液,搖勻后過0.22 μm有機濾膜過濾,得到相應濃度的基質匹配標準工作液。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品提取

準確稱取5.00 g粉碎均勻的茶葉樣品,與5 g硅藻土混勻后,移入34 mL不銹鋼樣品萃取池中進行加速溶劑萃取。提取溶劑為丙酮-正己烷(1∶1, v/v),萃取壓力為10 MPa,萃取溫度為100 ℃,加熱時間3 min,靜態(tài)萃取時間為5 min,循環(huán)1次,沖洗體積為40%萃取池體積,萃取結束后氮氣吹掃100 s,萃取液收集到60 mL收集瓶中。將萃取液轉移至100 mL雞心瓶中,于40 ℃水浴中減壓濃縮至近干,加入2 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)溶解殘渣,待凈化。

1.3.2樣品凈化

Cleanert TPT固相萃取柱中加入約2 cm高無水硫酸鈉,用10 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)預洗固相萃取柱,棄去流出液。將待凈化液轉移至固相萃取柱中,用2 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗滌濃縮瓶,重復1次,將2次洗滌液均轉入固相萃取柱中,收集流出液于雞心瓶中。用10 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗脫,收集流出液于同一雞心瓶中,于40 ℃水浴中減壓濃縮至約1 mL,用5 mL正己烷交換兩次,于40 ℃水浴中減壓濃縮至近干,用正己烷定容至2 mL,過0.22 μm有機濾膜,供氣相色譜-串聯(lián)質譜分析。

1.4 儀器條件

氣相色譜條件:色譜柱為SH-RXi-5Sil MS(30 m×0.25 mm, 0.25 μm);進樣口溫度:250 ℃;升溫程序:50 ℃保持1 min,以25 ℃/min的速度升至125 ℃,再以10 ℃/min的速度升至300 ℃,保持10 min;進樣方式:不分流進樣;柱流量:1.5 mL/min;載氣:高純氦氣(純度大于99.999%);進樣量:1 μL。

質譜條件:電子轟擊離子源(EI);離子源電壓:70 eV;離子源溫度:200 ℃;接口溫度:250 ℃;溶劑延遲時間:4 min;碰撞氣:氬氣(純度大于99.999%);掃描方式:多反應離子監(jiān)測(MRM)模式。

2 結果與討論

2.1 檢測條件的優(yōu)化

分別比較了氣相色譜-質譜(GC-MS)與氣相色譜-串聯(lián)質譜(GC-MS/MS)兩種檢測方法用于檢測茶葉中擬除蟲菊酯類農藥的靈敏度。首先用1 mg/L的混合標準使用液分別摸索GC-MS法和GC-MS/MS法的儀器條件,使9種農藥能夠得到較好的分離。GC-MS的掃描方式為選擇離子監(jiān)測模式(Q3-SIM), GC-MS/MS的掃描方式為MRM。優(yōu)化儀器條件后,分別用兩種方法測定相同濃度的茶葉基質匹配標準溶液(100 μg/L),重復進樣6次。結果表明,GC-MS/MS法得到的9種擬除蟲菊酯類農藥的平均響應值要比GC-MS法的平均響應值高,且基線更平滑,信噪比更高,因此,本文選擇采用GC-MS/MS法作為檢測茶葉農藥殘留的方法。

采用GC-MS/MS法時,質譜條件的優(yōu)化如下:將1 mg/L的9種擬除蟲菊酯類農藥混合標準使用液進行單極桿質譜全掃描(Q3-SCAN),通過譜庫檢索間接確定各組分農藥的保留時間,同時獲得每種農藥的代表性母離子碎片,再通過Smart Database MRM優(yōu)化工具確定各組分的碎片離子信息和碰撞能量,具體參數見表1。在優(yōu)化的質譜條件下,9種擬除蟲菊酯類農藥的空白綠茶基質匹配標準溶液(1 mg/L)的總離子流色譜圖見圖1。

圖 1 9種擬除蟲菊酯類農藥基質匹配標準溶液(1 mg/L)的總離子流色譜圖

2.2 分散劑的使用

樣品在填充入萃取池之前,可選擇加入或不加入分散劑進行分散處理。目前關于分散劑對茶葉中農藥殘留提取的影響鮮有報道。本文考察了分散劑添加與否對擬除蟲菊酯類農藥提取的影響。稱取兩組空白茶葉樣品,每組3個平行,9種擬除蟲菊酯類農藥的添加水平均為0.04 mg/kg,在相同萃取條件下,其中一組茶葉加入5 g常用分散劑硅藻土做分散處理,另一組不添加硅藻土,最后得到的回收率結果見圖2。顯然,樣品添加硅藻土后,9種擬除蟲菊酯類農藥的回收率均有不同程度的提高。這可能是因為在快速溶劑萃取過程中,高溫、高壓可能會導致樣品的積聚結塊,從而使萃取效率降低,而添加分散劑后,樣品積聚結塊的現象得以有效抑制,從而獲得更高的回收率。因此,本文選擇使用分散劑硅藻土(添加量為5 g)。

圖 2 添加硅藻土對9種擬除蟲菊酯類農藥回收率的影響

2.3 提取溶劑的選擇

乙腈、乙酸乙酯、丙酮、正己烷等是農藥殘留檢測中常用的、也是快速溶劑萃取允許使用的提取溶劑,本文分別比較了以上4種有機溶劑和丙酮-正己烷(1∶1, v/v)用于提取擬除蟲菊酯類農藥殘留時的提取效果。結果發(fā)現,不同溶劑得到的萃取液顏色深淺不同,由深到淺分別是丙酮>丙酮-正己烷(1∶1, v/v)>乙酸乙酯>乙腈>正己烷,乙腈和正己烷提取液顏色相對較淺。這表明,在高溫高壓的萃取條件下,丙酮、丙酮-正己烷(1∶1, v/v)、乙酸乙酯均會提取到大量的茶葉色素等雜質。

為了確定最優(yōu)的提取溶劑,本文使用以上5種溶劑進行空白基質加標回收試驗,9種擬除蟲菊酯類農藥的添加水平均為0.04 mg/kg。評價方法參考文獻[13]的評分方法,每種農藥組分分別使用5種有機溶劑提取后,將得到的回收率與100%的絕對差值進行比較,并由小到大進行排序,依次評分為1、2、3、4、5分,最后進行分數總和,分數越低,回收率越接近100%,提取效果越好,具體結果見表2。由表可知,乙腈和丙酮-正己烷(1∶1, v/v)的得分較低,對9種擬除蟲菊酯類農藥的提取效果比其他3種溶劑要好。雖然乙腈得分比丙酮-正己烷(1∶1, v/v)更低,但試驗中發(fā)現,用乙腈提取后,萃取液中出現了肉眼可見的絮狀沉淀,可能是茶葉中的多酚類、蛋白質等在乙腈中形成的不溶物。孟祥龍等[14]用快速溶劑萃取法選擇乙腈來提取糧谷中的多農藥殘留時,也出現了類似現象。這些絮狀沉淀的出現無疑會增加后續(xù)凈化步驟,且乙腈在濃縮換相時需要消耗更長的時間,故最終選擇丙酮-正己烷(1∶1, v/v)為提取溶劑。

表 2 不同溶劑的提取效果評分(n=3)

The numbers in the brackets are average recoveries (%).

表 3 不同溫度的提取效果評分(n=3)

The numbers in the brackets are average recoveries (%).

2.4 萃取條件的優(yōu)化

快速溶劑萃取可變的參數主要有萃取溫度、萃取壓力、加熱時間、萃取時間、沖洗體積、循環(huán)次數、氮氣吹掃時間等。研究發(fā)現,加熱時間、萃取時間在3 min以上時以及氮氣吹掃時間在60 s以上時,農藥殘留的回收率變化不大,故本試驗設置加熱時間為3 min,萃取時間為5 min,氮氣掃時間為100 s。而受限于收集瓶體積的緣故,設置循環(huán)次數為一次。綜上所述,本文主要研究萃取溫度、萃取壓力、沖洗體積對提取效果的影響。

2.4.1萃取溫度

加速溶劑萃取溫度一般選擇在40～120 ℃之間,在其他萃取條件相同的情況下,以萃取溫度為變量,分別考察40、60、80、100和120 ℃ 5個溫度水平對提取效果的影響,評價方法與2.3節(jié)相同,具體結果見表3。由表中數據可知,大多數農藥的回收率隨著萃取溫度的升高而呈現先升高后降低的趨勢,如聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯的回收率在40～100 ℃范圍內不斷上升,在100 ℃時達到最高值,在120 ℃時開始下降;氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟氰戊菊酯在40～60 ℃范圍內不斷上升,在60 ℃時達到最高值,從80 ℃時開始下降。這主要是因為,溫度的升高不僅可以提高擬除蟲菊酯類農藥殘留在萃取溶劑中的溶解度,還能夠降低萃取溶劑的粘度和表面張力,這樣就能使溶劑快速滲透到樣品基質中,加大農藥殘留的擴散速率,從而使提取效果變好。然而,過高的溫度可能會導致農藥殘留發(fā)生熱降解或者其他不可逆的形態(tài)轉化,從而使回收率出現下降現象。

由表3可知,40 ℃和120 ℃萃取條件下得到的總分最高,兩者皆不是最佳萃取溫度。60 ℃、80 ℃的得分接近,但均高于100 ℃。采用100 ℃萃取時得分最低,擬除蟲菊酯類農藥殘留總體提取效果最好,故最終選擇100 ℃為萃取溫度。

表 4 不同壓力的提取效果評分(n=3)

The numbers in the brackets are average recoveries (%).

2.4.2萃取壓力

在快速溶劑萃取中,萃取壓力的主要作用是保證萃取溶劑在高溫下保持液態(tài),一般設定壓力范圍為0～20 MPa。本文考察了0.5、5、10和15 MPa 4個壓力水平對提取效果的影響,評價方法與2.3節(jié)相同,具體結果見表4。由表可知,隨著萃取壓力的升高,絕大部分擬除蟲菊酯類農藥殘留的回收率也不斷上升,并在15 MPa時達到最高值。這主要是因為,在高壓條件下,萃取溶劑在高溫時不僅能保持液態(tài),同時能夠快速地滲透到樣品基質中,加快了農藥殘留目標物向萃取溶劑的轉移,所以回收率會隨著壓力的上升而上升。但在實際萃取過程中,萃取壓力并非越高越好,過高的壓力不僅會影響儀器的穩(wěn)定性和使用壽命,而且對農藥殘留提取幫助不大。從表4可以看出,當萃取壓力為0.5 MPa時,總分最高,提取效果最差,當萃取壓力為10 MPa時總分最低,提取效果最好,故最終選擇萃取壓力為10 MPa。

2.4.3沖洗體積

沖洗體積是指快速溶劑萃取結束后,使用干凈萃取溶劑沖洗殘渣的體積,一般以萃取池體積的百分比表示?？梢灶A見,在其他萃取條件相同的情況下,沖洗體積越大,提取效果越好。然而,如果采用過高的沖洗體積,在一定程度上會造成萃取溶劑的浪費,同時也會延長后續(xù)濃縮凈化的時間。本試驗考察了20%、40%、60% 3個沖洗體積水平對擬除蟲菊酯類農藥的提取效果。結果表明,在其他萃取條件完全相同的情況下,上述3個沖洗體積水平得到的9種擬除蟲菊酯類農藥殘留的回收率分別是58.39%～96.21%、61.40%～99.96%、62.77%～100.4%,采用40%沖洗體積與采用60%沖洗體積得到的回收率相差不大,故最終選擇沖洗體積為40%萃取池體積。

2.5 凈化條件的優(yōu)化

2.5.1固相萃取柱的選擇

茶葉中含有大量色素、多酚類、蠟質等需要凈化的雜質成分,分別比較了相同柱容量(1 g/6 mL)的Cleanert Florisil、Cleanert PestiCarb以及Cleanert TPT固相萃取柱對茶葉農藥殘留的凈化效果,發(fā)現用Cleanert Florisil、Cleanert PestiCarb固相萃取柱凈化后得到的凈化液顏色較深,濃縮后存在較多的殘渣,無法完全去除目標雜質,主要是因為兩者填充材料單一,對雜質的選擇性較高,并不能同時凈化上述茶葉中的幾類雜質。Cleanert TPT柱由3種材料按一定比例分層填裝而成,凈化后得到的凈化液澄清透明,殘渣量小,故選擇Cleanert TPT作為凈化柱。同時,本文還考察了兩種柱容量的Cleanert TPT柱對凈化效果的影響,發(fā)現當稱樣量為5 g時,2 g/10 mL容量柱得到的凈化液顏色接近無色,濃縮后幾乎無殘渣,凈化效果比1 g/6 mL容量柱好,故最終選擇2 g/10 mL柱容量的Cleanert TPT柱進行凈化處理。

2.5.2洗脫體積的確定

為確定洗脫體積,提取濃縮后的轉移液流出后先單獨收集,記為0 mL,而后分4次加入洗脫液進行洗脫,每次5 mL,分別收集相應的洗脫液,經分析后繪制流出曲線圖(見圖3)。容易看出,洗脫體積為5 mL時,9種擬除蟲菊酯類農藥的回收率基本達到了80%以上,洗脫體積在10 mL以上時,回收率基本上保持持平,故最終確定洗脫體積為10 mL。

圖 3 洗脫體積對9種擬除蟲菊酯類農藥回收率的影響

2.6 線性方程、檢出限和定量限

預實驗中發(fā)現,除了氟氯氰菊酯以外,其他8種擬除蟲菊酯類農藥均呈現出不同程度的基質增強效應。為消除背景干擾,本文采用空白基質液配制標準曲線。分別配制質量濃度為2、5、10、20、40、100、400、1 000 μg/L的空白綠茶基質匹配標準工作液進行測定,以定量離子峰面積y對質量濃度x(單位μg/L)做線性回歸,得到各組分農藥的線性方程和相關系數。采用加標回收的方法,以信噪比為3(S/N=3)確定檢出限(LOD),以信噪比為10(S/N=10)確定定量限(LOQ),結果見表1。由表可知,在2～1 000 μg/L的濃度范圍內,9種擬除蟲菊酯類農藥的線性相關系數均大于0.99,呈現出良好的線性關系。另外,9種擬除蟲菊酯類農藥的檢出限為0.2～4.5 μg/kg,均低于國家方法標準[7];定量限為0.8～15.0 μg/kg,顯示出較高的靈敏度。

2.7 回收率和精密度

在優(yōu)化后的實驗條件下,分別在綠茶、紅茶空白樣品中做加標回收試驗,添加水平為低、中、高3個濃度(0.02、0.1和0.4 mg/kg)以及LOQ水平,每個濃度做6個平行樣,得到的回收率和精密度數據見表5。在4個添加水平下,9種擬除蟲菊酯類農藥的平均回收率為69.87%～110.0%,相對標準偏差(RSD)為0.7%～11.2%,表明方法的準確度和精密度均能達到滿意結果。

2.8 實際樣品的測定

利用本文建立的方法對2018年送檢的25份茶葉樣品進行上述9種擬除蟲菊酯類農藥殘留的測定,其中一份茶葉檢出聯(lián)苯菊酯,但未超過規(guī)定的限量值,其余茶葉樣品均未檢出任何農藥組分。

表 5 綠茶、紅茶中9種擬除蟲菊酯類農藥殘留的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

3 結論

本文利用加速溶劑萃取結合固相萃取凈化的前處理技術,采用氣相色譜-串聯(lián)質譜進行測定,建立了茶葉中的9種擬除蟲菊酯類農藥殘留的檢測方法。通過優(yōu)化檢測條件和前處理過程,使用多反應監(jiān)測模式和基質校準曲線,使本方法背景干擾低、分離能力強、靈敏度高、重現性好、回收率穩(wěn)定,能夠滿足國內外對茶葉中多種擬除蟲菊酯類農藥殘留的檢測要求。