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    重組含糖識別結構域的人源半乳糖凝集素-3在糖蛋白/糖肽富集中的應用

    2018-12-06 03:09:30王明超應萬濤錢小紅
    色譜 2018年12期
    關鍵詞:親和柱糖肽凝集素

    趙 洋, 張 勇, 王明超, 孟 波, 應萬濤*, 錢小紅*

    (1. 北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院, 北京 100124; 2. 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生命組學研究所,蛋白質組學國家重點實驗室, 北京蛋白質組研究中心, 國家蛋白質科學中心-北京, 北京 102206)

    半乳糖凝集素是一類進化上十分保守的可溶性凝集素蛋白質。半乳糖凝集素含有一個或兩個長約130個氨基酸的糖識別結構域(CRD),對β-半乳糖苷具有特異的親和力[1,2]。迄今,已有約15種哺乳動物的半乳糖凝集素家族蛋白質被報道,根據CRD數目可被分為三大類:單一CRD的原型,兩個CRD的串聯(lián)重復型,以及含有一個CRD和一個膠原蛋白質樣重復結構域的嵌合型[3]。其中,半乳糖凝集素-3(Gal-3)是嵌合型中的重要成員[4],普遍存在于動物體內,主要通過非經典途徑分泌產生[5]。在人體內,Gal-3由位于14號染色體q21-22位點上的LGALS3基因編碼產生,在N端含有一個CRD區(qū)域,能與β-半乳糖及其綴合物特異性結合[6]。據報道,人源的Gal-3能與細胞內大量的糖蛋白相互作用,參與多種生物學過程,如細胞黏附、增殖、活化、凋亡等[7-10]。

    凝集素的CRD已被廣泛應用于糖蛋白/糖肽的富集與識別中,但目前絕大部分商業(yè)化凝集素都是植物凝集素,例如對高甘露糖具有特異親和力的伴刀豆凝集素、對N-乙酰葡萄糖氨和唾液酸具有特異親和力的麥胚凝集素、對半乳糖具有特異親和力的蓖麻凝集素等[11-15]。這些凝集素已在線蟲、鼠肝、血清、尿液等復雜樣本的糖蛋白質組富集分析中得到廣泛應用[16,17],但至今鮮有動物凝集素應用于糖蛋白質組的富集研究。因此,本研究基于人源Gal-3的CRD序列特征,在原核表達系統(tǒng)中構建了含有1個或4個串聯(lián)重復CRD結構域的重組Gal-3分子,并通過生化手段對其相對分子質量、純度、生物素化和糖蛋白結合特征等進行了綜合分析。隨后,將重組的凝集素蛋白質固定到鏈霉親和素瓊脂糖小球上,形成凝集素親和柱,應用于糖蛋白質組的富集分析研究中。

    1 實驗部分

    1.1 實驗材料和試劑

    菌種:人肝癌細胞系HepG2細胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC),本實驗室保存。大腸桿菌BL21(DE3)菌株購自中國康為世紀生物科技有限公司。PET28a-gal3c(單體)、PET28a-Gal3c(四聚體)和pBirA質粒購自中國華大基因股份有限公司,由本實驗室保存。

    培養(yǎng)基:細菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉10 g/L, pH 7.4, 121 ℃, 30 min),低于55 ℃時加入抗生素,固體培養(yǎng)基加1.5%(m/m)的瓊脂粉。細胞培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液(10%(v/v)胎牛血清,60 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)。

    試劑:三羥甲基甲烷、丙烯酰胺粉末、N,N-亞甲基二丙烯酰胺購自美國Bio-Rad公司;四甲基乙二胺、十二烷基磺酸鈉購自美國Promega公司;鎳親和純化凝膠(Ni-NTA-Agarose)購自中國克勞寧生物科技有限公司(北京);所用無機鹽類、乙酸、乙醇、考馬斯亮藍G250、EDTA等均為國產分析純,購自國藥試劑公司;實驗所用咪唑、卡那青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素等均購自中國生工生物科技有限公司(上海);消化細胞用的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(胰酶-EDTA)消化液、細胞培養(yǎng)用的青霉素和鏈霉素雙抗混合溶液、無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)均購自美國Hyclone公司;胎牛血清(BSA)購自美國Gibco公司;牛胎球蛋白、去唾液酸的牛胎球蛋白、牛脫鐵轉鐵蛋白、馬心肌紅蛋白、核糖核酸酶B、生物素均購于美國Sigma公司;生物素化的伴刀豆凝集素A、麥胚凝集素、小扁豆凝集素、雞冠珊瑚樹凝集素均購于德國Vector公司;辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(HRP-鏈霉親和素)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和增強化學發(fā)光(ECL)試劑盒均購于中國康為世紀公司;蛋白膠預染的標準蛋白質、鏈霉親和素瓊脂糖小球和旋轉柱均購于德國Thermo公司;親水色譜(HILIC)填料購于中國博納艾杰爾公司;Cocktail蛋白酶抑制劑購于瑞士Roche公司。

    儀器:串聯(lián)質譜Q-Exactive HF、二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機購、Nanodrop 2000型微量紫外光度計購于德國Thermo公司;高壓滅菌鍋購于日本Panasonic公司;超聲波破碎儀購于中國寧波新芝生物科技股份有限公司;伯樂電泳儀和電泳槽購于美國Bio-Rad公司;凝膠掃描儀購于中國惠普有限公司;超凈工作臺購于中國北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;脫色搖床購于中國冠森生物科技有限公司;-80 ℃超低溫冰箱購于日本Sanyo公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱購于中國上海浦東榮豐科學儀器有限公司;臺式恒溫振蕩器購于中國蘇州培英實驗設備有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1重組質粒構建

    根據人半乳糖凝集素-3的cDNA序列(Gene bank: CR542097.1)及已知的Gal3C結構,選取了其331~753位的核苷酸序列作為Gal3C的編碼序列。同時,在該序列的3′端添加了一段編碼Avi-tag的核苷酸序列:GTC TGA AAC GAC ATC TTC GAG GCT CAG AAA ATC GAA TGG CAC GAA,得到全長的片段。將該片段通過EcoR1和Xho1插入pET28a載體中,獲得pET28a-Gal3C表達質粒。為了獲得Tetra-Gal3C,在各個編碼片段之間加入柔性氨基酸標簽編碼序列GGC GGT GGT GGT GGT GGC,同時進行了密碼子優(yōu)化。DNA重組片段的合成以及質粒構建實驗由華大基因完成。將質粒轉化到感受態(tài)細胞之后,通過卡那霉素和氯霉素的雙重抗性篩選平板選擇共表達的BL21(DE3, Gal3C/BirA)和BL21(DE3, Tetra-Gal3C/BirA)菌株。

    1.2.2細菌培養(yǎng)及目標蛋白質的誘導表達

    人肝癌細胞系HepG2使用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),在37 ℃含5%(v/v)二氧化碳及95%(v/v)空氣飽和濕度溫箱中常規(guī)培養(yǎng)。細胞每24 h傳代培養(yǎng),48 h后用0.25%(m/m)胰酶-EDTA溶液消化收集細胞。

    在50 mL離心管中加入5 mL含50 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基,分別接入兩種含不同質粒的菌種進行活化。置于搖床上,37 ℃ 200 r/min條件培養(yǎng)過夜(~12 h)。活化后的菌種分別轉入含150 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中,置于搖床上37 ℃ 200 r/min條件培養(yǎng)約2 h,至菌溶液在600 nm波長處的吸光值(OD600)約為0.5時為止。降溫至30 ℃,向三角瓶中加入0.2 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和10 μg/mL的生物素,進行目標蛋白質誘導和生物素化。37 ℃ 160 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)8 h后轉入離心管中,4 ℃ 6 000 r/min條件下離心5 min,棄上清并收集菌體。用PBS緩沖液洗滌菌體后提取目標蛋白質(Gal3C和Tetra-Gal3C)。

    1.2.3目標蛋白質的提取和純化

    加入20 mL預冷的結合緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L pH 7.8的NaCl,含Cocktail蛋白酶抑制劑)重懸菌體,使用超聲進行破菌。10 000 g下離心30 min,保留的上清即為全蛋白提取液?;罨疦i-NTA-Agarose柱后,將全蛋白提取液重復過柱3次,讓目標蛋白質結合到鎳柱上。用40 mL的洗滌緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L pH 6.0的NaCl)洗去非特異性結合的蛋白質,最后用250 mmol/L咪唑洗脫并收集目標蛋白質。

    透析袋用水洗干凈,用透析夾夾住底部,加入高濃度咪唑洗脫下來的目標蛋白質溶液后,用透析夾封口,置于含1 L透析液(50 mL pH 7.8的10×PBS, 400 mL水,50 mL甘油)的燒杯中,用保鮮膜封口后置于4 ℃冰箱,磁力攪拌器攪拌過夜(約12 h),得到純化的含低濃度咪唑的目標蛋白質。

    1.2.4目標蛋白質和糖蛋白肽段的確證與定量

    利用Bradford方法對目標蛋白質進行定量,利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳方法評估蛋白質的相對分子質量及純度。利用Nanodrop對富集到的糖肽進行定量分析。

    1.2.5凝集素免疫印跡

    標準蛋白質或全蛋白提取液用SDS-PAGE分離,然后轉印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。PVDF膜置于封閉液(1×Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS), 0.05%(v/v)吐溫20, 5% (v/v) BSA)中,室溫封閉1 h。用含有0.05%(v/v)吐溫20的TBS (TBST)溶液清洗后,按1∶5 000體積比加入生物素化的Gal3C或Tetra-Gal3C或植物凝集素,4 ℃孵育過夜。用TBST清洗后,按體積比1∶5 000加入HRP-鏈霉親和素,室溫孵育1 h。TBST清洗后,加入DAB或ECL試劑進行顯影。

    1.2.6凝集素柱制備和糖蛋白富集

    加200 μL的鏈霉親和素瓊脂糖小球到旋轉柱中,用200 μL預冷的PBS平衡柱子2次。加入500 μg的Gal3C或Tetra-Gal3C, 4 ℃旋轉孵育1 h固定目標蛋白質,即為凝集素親和柱。用注射器推壓收集未結合的目標蛋白質并用PBS洗滌2次。

    加入標準蛋白質或全蛋白提取液(HepG2細胞用PBS和0.1%(v/v)Triton X-100重懸,使用超聲破碎提取的全蛋白溶液)到該凝集素親和柱中,4 ℃旋轉孵育過夜。置于冰上自然沉淀,注射器推壓收集未結合蛋白質并進行蛋白質濃度測定。用400 μL的PBS洗滌非特異性結合蛋白質。加100 μL的8 mol/L尿素溶液到該凝集素親和柱中洗脫糖蛋白,37 ℃旋轉孵育30 min。用注射器推壓收集洗脫液,重復洗脫一次,洗脫液包含富集的糖蛋白。

    1.2.7糖蛋白酶切

    將洗脫液加入到30 kD的超濾管中,加200 μL的8 mol/L尿素溶液,14 000 g下離心10 min。加入終濃度20 mmol/L的二硫蘇糖醇,在37 ℃還原反應4 h,之后加入終濃度50 mmol/L的碘乙酰胺,室溫暗處反應30 min。用200 μL的50 mmol/L碳酸氫銨替換溶液。更換新的套管,按胰蛋白酶和糖蛋白質量比1∶50加入胰蛋白酶,在37 ℃旋轉反應過夜,14 000 g下離心10 min,收集酶切肽段。真空冷凍干燥肽段,用0.1%(v/v)甲酸復溶后取500 ng進行質譜分析。

    1.2.8質譜分析

    生物質譜儀為串聯(lián)質譜Q-Exactive HF。反相色譜直噴柱采用Magic C18柱(內徑150 μm,柱長12 cm, C18填料直徑為3 μm)。然后利用流動相A液為含有0.1%(v/v)甲酸的超純水,B液為含有0.1%(v/v)甲酸的純乙腈,線性梯度為6%B~32%B,流速0.6 μL/min,進行78 min的液相色譜分離,隨后進Q-Exactive HF質譜檢測。Q-Exactive HF質譜檢測條件:碎裂模式為高能碰撞解離模式(HCD),電離方式為納升級電噴霧電離(Nano-ESI),采用正離子模式進行掃描,電離電壓采用默認設置,一級質譜離子掃描的范圍為300~1 400 Da,分辨率為120 000,自動增益控制(AGC)設置為3×106,最大注入時間(IT)設置為80 ms;二級質譜Top N設置為20, AGC設置為5×104,最大IT設置為45 ms,動態(tài)排除時間設置為12 s,質量數據由XCalibur進行實時采集。

    1.2.9數據處理

    質譜分析獲得的RAW文件使用MaxQuant軟件(1.5.3.8版)進行分析。參數設置:酶切方式為Trypsin,最大漏切位點為2。固定修飾設置為Carboxyamidomethylation (C);可變修飾設置為Acetyl (Protein N-term)、Oxidation (M);其他參數均為默認值。

    2 結果與討論

    2.1 重組半乳糖凝集素-3的表征

    重組構建了含有CRD結構域的人源半乳糖凝集素-3,依據CRD結構域數目分別命名為Gal3C和Tetra-Gal3C。為了更好地分離純化重組凝集素蛋白質,在兩種凝集素蛋白質上均構建了兩個His標簽,便于使用鎳柱(Ni-NTA-Agarose)分離純化。同時,還構建了一個由15個氨基酸殘基組成的Avi標簽,為固定化到鏈霉親和素瓊脂糖小球提供專一性結合位點[18]。Gal3C含有199個氨基酸,大約為22.5 kD; Tetra-Gal3C含有639個氨基酸,大約為71.1 kD。如圖1a所示,通過鎳柱分離純化后,獲得了高純度的重組半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C,純度大于95%。為了評估重組半乳糖凝集素與鏈霉親和素的特異親和力,選取了HRP-鏈霉親和素作為抗體進行了免疫印跡分析[19]。如圖1b所示,重組半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C與HRP-鏈霉親和素發(fā)生明顯的相互作用,即Gal3C和Tetra-Gal3C成功發(fā)生了生物素化。

    圖 1 重組半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C的SDS-PAGE和免疫印跡圖

    圖 2 重組半乳糖凝集素結構和凝集素親和柱富集糖蛋白/糖肽流程示意圖

    2.2 重組半乳糖凝集素糖蛋白/糖肽富集流程

    如圖2所示,Gal3C僅含有一個CRD結構域,而Tetra-Gal3C通過聚甘氨酸接頭連接了4個CRD結構域。同時,Gal3C和Tetra-Gal3C均含有兩個His標簽和一個Avi標簽,并發(fā)生生物素化修飾。當Gal3C和Tetra-Gal3C與鏈霉親和素瓊脂糖小球混合孵育時,由于生物素環(huán)形結構中的咪唑酮環(huán)能與鏈霉親和素發(fā)生共價結合[20],致使重組凝集素特異性地固定于鏈霉親和素瓊脂糖小球上,制作成凝集素親和柱,進而可應用于糖蛋白/糖肽的親和富集。

    2.3 重組半乳糖凝集素親和富集標準糖蛋白

    人源的半乳糖凝集素-3偏向于識別并結合N-糖蛋白,特別是含有N-乙酰乳糖胺修飾的糖蛋白[21]。為了驗證重組凝集素是否具有相似的糖蛋白富集特性,利用6種標準蛋白質對其進行驗證,包括去唾液酸的胎球蛋白A(AF)、牛血清白蛋白(BSA)、胎球蛋白A(F)、馬心肌紅蛋白(Mb)、核糖核酸酶B(RB)、牛轉鐵蛋白(T)。其中,AF、F、RB和T是N-糖蛋白,BSA和Mb是非糖蛋白。如圖3a所示,6種標準蛋白質的純度均在90%以上,但由于BSA與AF和F的分子量較為接近,最終采用了5種標準蛋白質的混合物進行糖蛋白富集分析,不包括BSA。

    為了評價重組凝集素對N-糖蛋白的特異性識別和結合能力,進行了凝集素免疫印跡分析,即將生物素化的重組半乳糖凝集素-3(Gal3C和Tetra-Gal3C)作為“一抗”,與轉印到PVDF膜上的標準蛋白質混合孵育,洗滌之后與HRP-鏈霉親和素孵育,最后用DAB或ECL試劑盒顯色。如圖3b和3c所示,Gal3C和Tetra-Gal3C均能結合N-糖蛋白AF、F、RB和T,而不與非糖蛋白BSA和Mb結合,表明生物素化的重組凝集素作為“一抗”檢測靈敏度高,且具有N-糖蛋白的特異性識別和結合能力。

    為了評估重組凝集素親和柱的糖蛋白富集效能,將Gal3C和Tetra-Gal3C固定到鏈霉親和素瓊脂糖小球上,利用形成的重組凝集素親和柱去富集5種標準蛋白質混合物中的糖蛋白。如圖3d和3e所示,5種標準蛋白(AF、F、Mb、RB和T)具有不同的相對分子質量,其混合物能夠在SDS-PAGE膠上清晰地分為5個標準的蛋白質條帶。經過Gal3C和Tetra-Gal3C凝集素親和柱富集后,3種N-糖蛋白(AF、F和T)都得到了明顯的富集,特別是AF糖蛋白。結果表明Gal3C和Tetra-Gal3C凝集素親和柱對N-糖蛋白具有特異的識別和結合能力。此外,在洗滌液中也鑒定到了5種標準蛋白質的蛋白質條帶(見圖3d和3e),這是因為每種蛋白質的糖基化修飾程度并不相同,未發(fā)生修飾或弱結合的蛋白質都被洗滌出來。同時,進一步驗證了Tetra-Gal3C凝集素親和柱對3種N-糖蛋白的親和性。如圖3f所示,Tetra-Gal3C對3種N-糖蛋白(AF、F和T)都表現出了良好的親和特性,特別是AF糖蛋白。綜上所述,這些結果都表明重組凝集素親和柱能特異性地結合N-糖蛋白,具有應用于糖蛋白質組富集分析的潛能。

    圖 3 重組半乳糖凝集素結合糖蛋白能力分析

    圖 4 植物凝集素的糖蛋白親和性評估

    為了評估重組Tetra-Gal3C凝集素對糖鏈的親和特異性,選用了4種植物凝集素對6種標準蛋白質進行了免疫印跡分析[22,23],包括伴刀豆凝集素A(ConA)、麥胚凝集素(WGA)、小扁豆凝集素(LCA)、雞冠珊瑚樹凝集素(ECA)。據文獻報道[11-13,24], ConA可特異性地與高甘露糖型糖鏈親和作用,WGA可特異性地與β1-4或β1-2連接的N-乙酰葡萄糖胺及唾液酸糖鏈親和作用,LCA可特異性地與高甘露糖型糖鏈親和作用,ECA則特異性地與末端為半乳糖或N-乙酰半乳糖胺糖鏈親和作用。如圖4所示,F蛋白傾向與WGA親和作用,表明其唾液酸糖鏈較多;AF蛋白傾向與ECA親和作用,表明其含有半乳糖或N-乙酰半乳糖胺糖鏈;RB蛋白和T蛋白能與4種植物凝集素結合,表明含有多種糖鏈;而BSA和Mb蛋白均不與植物凝集素結合,表明這兩類蛋白都不含有糖鏈。綜上所述,重組的人源凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C與植物凝集素ECA類似,兩者都能與含有N-乙酰半乳糖胺修飾的AF蛋白發(fā)生親和作用,并且具有較高的選擇性和特異性,因此可適用于此類糖蛋白/糖肽的富集。

    圖 5 HILIC, Gal3C和Tetra-Gal3C材料的糖肽富集能力對比圖(n=3)

    圖 6 重組半乳糖凝集素親和柱在HepG2細胞全蛋白裂解液中糖蛋白富集分析的應用

    為了進一步評估重組凝集素的糖蛋白/糖肽富集能力,將50 μg的AF肽段分別使用糖肽富集材料HILIC、重組凝集素材料Gal3C和Tetra-Gal3C進行富集分析。通過定量比較分析,發(fā)現凝集素材料Tetra-Gal3C能夠富集到更多的AF蛋白的糖肽,約為凝集素材料Gal3C的1.5倍和HILIC材料的2倍(見圖5)。這一結果表明,Tetra-Gal3C由于含有4個串聯(lián)重復的CRD結構域,因而具有更高的糖肽負載量,能夠結合更多的糖肽。然而,Tetra-Gal3C的4個CRD結構域排列緊密,導致富集的糖蛋白或糖肽在空間結構上存在一定的位阻排斥效應,因此富集的糖肽含量不足Gal3C的4倍。同時,也發(fā)現凝集素材料對AF蛋白的糖肽富集率均高于HILIC,表明重組凝集素材料對N-乙酰半乳糖胺糖肽具有更高的親和性。

    2.4 重組凝集素在復雜樣本中糖蛋白/糖肽富集中的應用

    進一步評估了重組凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C在復雜樣本中富集糖蛋白/糖肽的能力。如圖6a和6b所示,重組凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C從HepG2細胞全蛋白(H)中富集了大量的糖蛋白。同時,觀測到大量非糖蛋白未被重組凝集素富集,表明重組凝集素具有糖蛋白親和特異性。然后利用重組凝集素作為“一抗”進行免疫印跡分析,通過ECL和DAB顯影,發(fā)現重組凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C能夠明顯地與大量糖蛋白結合,且兩種凝集素結合的蛋白非常類似,如圖6c和6d所示。其中Tetra-Gal3C對某些特異的糖蛋白表現出了更強的親和能力,導致顯影更加明顯。

    利用空載的鏈霉親和素瓊脂糖小球作為空白對照,進一步分析了重組凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C親和柱的糖蛋白富集能力。與對照組相比,重組凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C親和柱均從HepG2細胞全蛋白中特異性的富集到了208種UniProt數據庫中已知的糖蛋白。Tetra-Gal3C對其中的106個蛋白表現出了更高親和性,富集到的糖蛋白峰度明顯大于Gal3C富集到的糖蛋白峰度(>1.5倍,見圖7)。其中,SLC7A1、ABCC4和NPC1 3個蛋白的富集倍數差高達9倍。相對Tetra-Gal3C而言,僅有44個糖蛋白表現出對Gal3C更高的親和性(<0.75倍,見圖7)。通過熱圖對比分析150個差異富集糖蛋白的蛋白質峰度,也發(fā)現兩種材料對這150個糖蛋白有特異的親和性(見圖8)。由此我們認為,Tetra-Gal3C由于具有四重串聯(lián)的CRD結構域,相對于僅有一個CRD結構域的Gal3C而言,具有更高的糖鏈負載量,能夠富集更多的糖蛋白??臻g結構原因可能導致Tetra-Gal3C對少量糖蛋白的富集能力相對減弱,因此Gal3C表現出了更高的富集特性??傮w說來,這一結果表明重組凝集素親和柱具有從復雜生物樣本中富集糖蛋白/糖肽的潛能,可應用于復雜樣本的糖蛋白質組富集分析。

    圖 7 Tetra-Gal3C和Gal3C糖蛋白富集能力的對比

    圖 8 Tetra-Gal3C和Gal3C差異富集的糖蛋白峰強度熱圖

    3 結論

    半乳糖凝集素-3是半乳糖凝集素家族中的重要成員,具有廣泛的生物學功能,參與細胞的黏附、增殖、凋亡等生物學過程[25-27]。本文聚焦于半乳糖凝集素-3的CRD結構域在糖蛋白質組富集分析中的應用。首先,利用基因重組技術構建了一組含有一個或四個串聯(lián)重復CRD結構域的人源半乳糖凝集素-3: Gal3C和Tetra-Gal3C。其次,通過生化表征和標準蛋白評估,證明了重組人源半乳糖凝集素具有糖鏈識別和結合的特異性,尤其是對N-乙酰半乳糖胺修飾的糖蛋白/糖肽具有顯著的親和特性。最后,將其固定化到鏈霉親和素瓊脂糖小球制作成凝集素親和柱,應用于復雜生物樣本中的糖蛋白/糖肽富集分析,并取得了良好的富集效果。因此,證明人源重組凝集素具有富集糖蛋白/糖肽的能力,可適用于復雜生物樣本的糖蛋白質組富集分析。

    綜上所述,本文建立了人源重組半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C的表達和制備方法,為人源半乳糖凝集素的生物功能研究提供了可能的實驗材料。同時,基于重組哺乳動物凝集素糖結合結構域,提供了一種新的糖蛋白質組富集策略,有望推進復雜生物體系糖蛋白質組的研究。

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