白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影響

江 楓， 劉 麗， 張 公 亮,2， 侯 紅 漫,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 遼寧省水產(chǎn)品加工質(zhì)量安全與控制重點(diǎn)實驗室， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

群體感應(yīng)是細(xì)菌細(xì)胞間信號傳導(dǎo)和基因調(diào)控機(jī)制，能引起細(xì)菌致病性和食品腐敗變質(zhì)。因此，阻斷細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)可以抑制群體感應(yīng)控制的表型(例如：生物發(fā)光、生物膜形成、胞外酶合成)表達(dá)，控制食品的腐敗。有研究表明，群體感應(yīng)系統(tǒng)參與生物膜形成的所有階段，調(diào)節(jié)種群密度和成熟的生物膜內(nèi)的代謝活動，以適應(yīng)營養(yǎng)需求和現(xiàn)有資源[1]。群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitor，QSI)是指化學(xué)穩(wěn)定的、高效的低分子質(zhì)量分子，其對群體感應(yīng)控制的表型顯示出高度的特異性且沒有毒性副作用[2]。

白藜蘆醇是一種天然高效的抗生物膜活性制劑，Augustine等[3]首次報道亞抑菌濃度白藜蘆醇能顯著抑制V.cholerae生物被膜形成；Lee等[4]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能有效抑制大腸桿菌和銅綠假單胞菌生物膜形成。而白藜蘆醇對水產(chǎn)品中優(yōu)勢腐敗菌生物膜的影響報道較少。

蜂房哈夫尼菌在冷凍牛肉、雞肉、生牛奶和魚糜制品等食品腐敗期間是一種主要的優(yōu)勢腐敗細(xì)菌，在微生物食物腐敗中起重要作用。前期工作已發(fā)現(xiàn)蜂房哈夫尼菌具有生物膜形成能力，本實驗探究白藜蘆醇對分離自即食海參的蜂房哈夫尼菌的抗生物膜活性，以期為進(jìn)一步探究群體感應(yīng)系統(tǒng)與生物膜的形成關(guān)系奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

結(jié)晶紫染色液，PBS，標(biāo)準(zhǔn)品C6-HSL，白藜蘆醇，MH(B)培養(yǎng)基，卡那霉素；酶標(biāo)儀。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L；pH (7.0±0.2)。STA瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂0.65%；pH (7.0±0.2)。Swimming培養(yǎng)基：蛋白胨1%，氯化鈉0.25%，瓊脂0.3%，均在121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種的復(fù)蘇

菌種：蜂房哈夫尼菌、紫色桿菌CV026。

將蜂房哈夫尼菌平板劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，挑取單菌落于100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，制備成種子液。

將紫色桿菌CV026接種于100 mL無菌LB培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)16 h，取1 mL 菌液轉(zhuǎn)接至含20 μg/mL卡那霉素的100 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h。

1.2.3 最低抑菌濃度的測定

通過改良的微量肉湯稀釋法測定最低抑菌濃度，分別檢測白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌、紫色桿菌CV026的最低抑菌濃度(MIC)。

最低抑菌濃度：以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長所需的最小藥物濃度作為最低抑菌濃度。

1.2.4 報告菌平板法檢測白藜蘆醇及抑菌實驗

按照報告菌平板法定性檢測QSI[5]。

1.2.5 紫色桿菌素提取法定量檢測白藜蘆醇及抑菌試驗

按照紫色桿菌素提取法定量檢測QSI[6]。將CV026菌液、C6-HSL和不同濃度白藜蘆醇分別混合后，加入96微孔板中。28 ℃培養(yǎng)48 h，將孔板水分烘干。向各孔中加入DMSO，搖床振蕩2 h，使紫色桿菌素溶出，測定OD590。

抑菌實驗時LB肉湯中不添加C6-HSL，其余過程同上，培養(yǎng)24 h，測定OD600。

1.2.6 白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影響

通過結(jié)晶紫染色法[7]測定白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影響。在96孔板中依次加入LB肉湯、不同濃度白藜蘆醇和蜂房哈夫尼菌液，陽性對照孔不加白藜蘆醇，30 ℃培養(yǎng)24 h后測定菌液OD600。去除孔板中的浮游細(xì)菌，用PBS洗滌，再用無水甲醇固定、結(jié)晶紫染色，加入冰醋酸溶解后測定OD590。通過生物膜成膜量評判標(biāo)準(zhǔn)判斷其生物膜形成能力。

1.2.7 白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌游動能力的影響

在Swimming培養(yǎng)基中分別加入不同濃度白藜蘆醇為實驗組，以加生理鹽水作為陽性對照[8]。取3 μL蜂房哈夫尼菌液點(diǎn)到平板中央，于30 ℃培養(yǎng)24 h，測定擴(kuò)散圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌的抑菌活性

如圖1所示，經(jīng)30 ℃培養(yǎng)24 h后，白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌的抑制活性隨濃度增加而增強(qiáng)；在256 μg/mL時能完全抑制蜂房哈夫尼菌的生長(P<0.01)，因此白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌的最低抑菌濃度為256 μg/mL。

圖1 白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌的抑制作用

2.2 白藜蘆醇對CV026的抑菌活性

如圖2所示，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，隨著質(zhì)量濃度的增加，白藜蘆醇對CV026抑制活性逐漸增強(qiáng)；當(dāng)白藜蘆醇質(zhì)量濃度為128 μg/mL時，能完全抑制CV026的生長(P<0.01)。可見白藜蘆醇對紫色桿菌CV026最低抑菌濃度為128 μg/mL，以下實驗均在白藜蘆醇的亞抑菌濃度下進(jìn)行。

圖2 白藜蘆醇對CV026抑菌作用

2.3 CV026定性檢測白藜蘆醇抑制效果

CV026中紫色桿菌素的產(chǎn)生受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，若樣品中含有群體感應(yīng)抑制劑，將抑制CV026產(chǎn)生紫色，在小孔周圍出現(xiàn)白色、渾濁且不透明的抑制圈。抑制圈的直徑隨濃度增加而增加，如圖3所示。白藜蘆醇產(chǎn)生了這種特異性的特征圈(圖3(a))。對照組(圖3(b))小孔周圍沒有產(chǎn)生抑菌圈，說明白藜蘆醇可以干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)。從圖3(a)中可知，特征圈直徑隨白藜蘆醇濃度降低而減小。對溶劑DMSO進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其未含有群體感應(yīng)抑制劑作用和抑菌作用。

1～4，ρ=16，8，4，2 μg/mL；CK，二甲基亞砜

2.4 CV026定量檢測白藜蘆醇抑制效果

選擇4種不同亞抑菌濃度進(jìn)行實驗，如圖4所示。結(jié)果表明，與對照組相比，白藜蘆醇在16 μg/mL 時顯著抑制CV026產(chǎn)紫色桿菌素的能力(P<0.01)。隨著白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增大，其對紫色桿菌素產(chǎn)量的抑制率逐漸增大，抑制率從18.5%升高到74.9%。實驗結(jié)果與Truchado等[9]的基本一致。為確定對紫色桿菌素產(chǎn)量的抑制并不是抑菌活性的作用，測定了白藜蘆醇對CV026生長的影響。結(jié)果表明，白藜蘆醇不影響CV026的生長。

圖4 白藜蘆醇對紫色桿菌素產(chǎn)量的抑制作用

2.5 白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌生物膜形成的抑制作用

如圖5所示，蜂房哈夫尼菌在不同質(zhì)量濃度白藜蘆醇作用下能夠顯著抑制蜂房哈夫尼菌生物膜的形成(P<0.01)，最大抑制率達(dá)到79.1%，沒有生物膜產(chǎn)生。圖5還顯示，浮游菌的OD不隨白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增加而改變，這證明白藜蘆醇的生物膜抑制活性并不是由于其抗菌活性的作用。但是生物膜中細(xì)菌的OD會隨白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增大而減小。

圖5 白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌生物膜形成的抑制作用

Fig.5 Inhibition of the biofilm formation ofH.alveiby resveratrol

2.6 白藜蘆醇抑制蜂房哈夫尼菌游動能力

蜂房哈夫尼菌生物膜形成過程中，依賴于鞭毛運(yùn)動的細(xì)菌運(yùn)動能力和生物膜形成密切相關(guān)，并同時受到群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控，干擾細(xì)菌鞭毛的合成過程能影響細(xì)菌的運(yùn)動和定植能力，細(xì)胞的游動能力對其生物被膜的形成具有十分重要的作用[10]。如表1所示，在亞抑菌濃度下，白藜蘆醇能顯著抑制蜂房哈夫尼菌群體感應(yīng)依賴的游動能力(P<0.01)。在質(zhì)量濃度為16 μg/mL時，最大抑制率達(dá)到74.1%。如圖6所示，隨著白藜蘆醇質(zhì)量濃度逐漸增大，蜂房哈夫尼菌遷移距離縮短，游動能力逐漸降低。

表1 不同質(zhì)量濃度白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌的作用

Tab.1 The effect of different concentrations of resveratrol onH.alvei

ρ/(μg·mL-1)d/mm抑制率/%OD600062.1±0.300.68±0.20243.3±0.530.20.69±0.10438.2±0.438.50.69±0.30830.4±0.651.00.69±0.101616.1±0.274.10.69±0.20

圖6 白藜蘆醇對蜂房哈夫尼菌游動能力抑制作用

3 結(jié) 論

白藜蘆醇在亞抑菌濃度下，能夠抑制由群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的紫色桿菌CV026中紫色桿菌素的產(chǎn)量，并且具有濃度依賴性，當(dāng)質(zhì)量濃度為16 μg/mL 時紫色桿菌素產(chǎn)量最低，表明其具有群體感應(yīng)抑制作用；白藜蘆醇還能抑制蜂房哈夫尼菌生物膜形成及游動能力，質(zhì)量濃度為16 μg/mL時抑制作用最大。研究結(jié)果為控制食品腐敗、提高食品安全奠定研究基礎(chǔ)。