肽基脯氨酰異構(gòu)酶Pin1在動(dòng)脈粥樣硬化的血管平滑肌細(xì)胞衰老中的作用

張雪 呂磊 王鵬 袁凱 李茂然 張紀(jì)蔚 孟秋蓉 梁衛(wèi)

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院南院科（上海 201112）；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院（上海200127）

細(xì)胞衰老限制了正常細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)出一系列形態(tài)學(xué)和生理學(xué)上的改變，如細(xì)胞形態(tài)增大而扁平、酸性β-半乳糖苷酶活性增強(qiáng)以及基因表達(dá)模式改變［1-2］。動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是慢性炎癥性疾病，許多潛在機(jī)制參與其中，眾多證據(jù)表明血管細(xì)胞的衰老及凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化中起重要作用［3-4］。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）作為血管壁固有的最豐富的細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化的病理進(jìn)程中扮演主要角色［5-6］。

肽基脯氨酰異構(gòu)酶（peptidyl-proplyl Isomerase，Pin1）是唯一能使特定的磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白肽鍵發(fā)生異構(gòu)的酶，能誘導(dǎo)靶蛋白發(fā)生構(gòu)像改變，代表了一種新的蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。該機(jī)制被嚴(yán)格控制，只在某一范圍內(nèi)的生理及病理情況下發(fā)揮作用［7-8］。Pin1發(fā)揮分子計(jì)時(shí)器的功能，嚴(yán)格控制細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞分裂，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老［1，9］。研究表明，Pin1在阿爾茨海默病和許多癌癥的發(fā)病機(jī)理中充當(dāng)重要的調(diào)節(jié)因子［10］。本課題組研究揭示，Pin1在調(diào)節(jié)VSMCs增殖中發(fā)揮促進(jìn)作用［11-12］，但其在VSMCs衰老中的作用還未被研究。有趣的是，在最近的研究中，本課題組在動(dòng)脈粥樣硬化的股動(dòng)脈組織中觀察到了Pin1表達(dá)水平的下調(diào)，同時(shí)伴有VSMCs衰老程度的增加。因此，本研究試圖確定Pin1在人體動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs衰老中的作用。

1 材料與方法

1.1材料動(dòng)脈粥樣硬化的股動(dòng)脈標(biāo)本來(lái)自于6例2012年5月至2013年7月在上海仁濟(jì)醫(yī)院接受股腘動(dòng)脈人工血管轉(zhuǎn)流術(shù)的嚴(yán)重動(dòng)脈粥樣硬化患者（年齡53～83歲，平均年齡64歲）。正常股動(dòng)脈標(biāo)本來(lái)自5位捐獻(xiàn)者（年齡42～78歲，平均年齡63歲），均在2012年5月至2014年6月期間因下肢嚴(yán)重創(chuàng)傷在上海仁濟(jì)醫(yī)院接受截肢手術(shù)。所有參與者皆簽署了知情同意書(shū)。血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）由本實(shí)驗(yàn)室對(duì)股動(dòng)脈組織進(jìn)行原代培養(yǎng)所得［11］。上海仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)了此實(shí)驗(yàn)方案。

1.2試劑抗Pin1抗體、抗視網(wǎng)膜母細(xì)胞抗體（anti-pRb）、抗磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞抗體（anti-ppRb）、以及抗β-肌動(dòng)蛋白抗體（英國(guó)Abcam公司），抗周期蛋白B抗體、抗周期蛋白E抗體（美國(guó)BD Pharmingen公司），抗周期蛋白D抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），TeloTAGGGTelomerase PCR ELISA試劑盒（德國(guó)Roche Applied Science公司），表達(dá)Pin1的腺病毒（Ad-Pin1）及對(duì)照的腺病毒（Ad-LacZ）（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)從血管上輕柔地分離掉外膜和內(nèi)膜細(xì)胞，將VSMCs用組織貼片法培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中，置于37℃、5.0%CO2的培養(yǎng)箱中。VSMCs由平滑肌細(xì)胞a-肌動(dòng)蛋白免疫染色驗(yàn)證。在所有實(shí)驗(yàn)之前，細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)24 h的血清饑餓處理。

1.3.2運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)人體動(dòng)脈粥樣硬化病變的股動(dòng)脈組織中Pin1的表達(dá)將股動(dòng)脈組織在多聚甲醛中貯存24 h，隨后放入乙醇中貯藏直到石蠟包埋。免疫組化技術(shù)的應(yīng)用如前所述［13］。非特異性染色檢測(cè)相應(yīng)IgG的陰性對(duì)照組。

1.3.3利用改良的TRAP法分別檢測(cè)正常及動(dòng)脈粥樣硬化的股動(dòng)脈組織中VSMCs的衰老情況運(yùn)用光度酶免疫分析法結(jié)合端粒擴(kuò)增法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞端粒酶活性。分離的細(xì)胞當(dāng)量為1×103，均通過(guò)TeloTAGGGTelomerase PCR ELISA試劑盒來(lái)檢測(cè)端粒酶活性，詳細(xì)步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.3.4運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡分析法檢測(cè)VSMCs和過(guò)表達(dá)Pin1的人體動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs中pRb通路以及cyclin通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)如前所述，VSMCs分為對(duì)照組（Ad-LacZ）和過(guò)表達(dá)Pin1組（Ad-Pin1），在無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行6 h的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)［14］。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)根據(jù)前述的標(biāo)準(zhǔn)方案來(lái)實(shí)施［11］。β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以形式表示。運(yùn)用D′Agostino和Pearson多項(xiàng)性檢驗(yàn)對(duì)正態(tài)分布進(jìn)行了檢驗(yàn)。如果值呈正態(tài)分布，那么對(duì)兩組間差異進(jìn)行Student′st檢驗(yàn)求得未配對(duì)均值，兩組以上的差值進(jìn)行方差分析后進(jìn)行Bonferroni′s多重比較分析檢驗(yàn)。如果結(jié)果不服從正態(tài)分布，那么差異將分別由Mann-Whitney或Kruskall-Wallis檢驗(yàn)以及Dunn′s事后分析來(lái)進(jìn)行比較。以P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1人體動(dòng)脈粥樣硬化病變的股動(dòng)脈組織中Pin1表達(dá)下調(diào)與對(duì)照組血管（正常股動(dòng)脈）相比，人動(dòng)脈粥樣硬化股動(dòng)脈組織（n=10）中Pin1蛋白表達(dá)水平（圖1，×100倍）明顯下調(diào)（P＜0.05），組間的患者數(shù)據(jù)沒(méi)有差別，這些數(shù)據(jù)包括年齡、性別、高血壓或糖尿病患者比例、吸煙患者比例以及最近三個(gè)月內(nèi)服用他汀類(lèi)藥物患者比例。

2.2動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs衰老增加與正常VSMCs相比，動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs端粒酶活性被抑制（P＜0.05）（圖2）。

2.3Pin1抑制VSMCs衰老和pRb磷酸化與正常VSMCs相比，動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs中p-pRb的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；與對(duì)照組（Ad-LacZ）相比，過(guò)表達(dá)Pin1組（Ad-Pin1）人動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs中p-pRb的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），這提示Pin1通過(guò)抑制pRb磷酸化來(lái)防止VSMCs衰老。

圖1 免疫組化檢測(cè)人正常和動(dòng)脈粥樣硬化的股動(dòng)脈組織中Pin1的表達(dá)Fig.1 Detection of Pin1 level in normal and atherosclerotic femoral artery by immunohistochemistry

圖2 改良的TRAP法檢測(cè)體外Pin1對(duì)VSMCs衰老的影響Fig.2 Detecting the effect of Pin1 on the senescence of VSMCs in vitro using a modified TRAP assay

2.4Pin1調(diào)節(jié)VSMCs衰老以及改變不同細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)與正常VSMCs相比，動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs中細(xì)胞周期蛋白B、D和E表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.05）；與對(duì)照組（Ad-LacZ）相比，過(guò)表達(dá)Pin1組（Ad-Pin1）人動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs中細(xì)胞周期蛋白B、D和E表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。

圖4 蛋白質(zhì)印跡分析法檢測(cè)VSMCs中細(xì)胞周期蛋白B、D和E的表達(dá)Fig.4 Detection of Cyclin B，D and E levels in VSMCs by Western blot

3 討論

根據(jù)目前的研究，Pin1表達(dá)水平的下調(diào)很可能是促進(jìn)VSMCs衰老及動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)因素。本研究闡述了人體動(dòng)脈粥樣硬化VSMCs中Pin1表達(dá)的下調(diào)及其與VSMCs衰老的關(guān)系。本課題組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，相比于正常情況，動(dòng)脈粥樣硬化的股動(dòng)脈組織中Pin1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，同時(shí)動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs端粒酶活性被抑制。為了進(jìn)一步探究Pin1抑制VSMCs衰老的機(jī)制，本研究檢測(cè)了VSMCs中一些重要的衰老調(diào)節(jié)因子。結(jié)果表明，動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs中，p-pRb的蛋白水平明顯增加。相反，在動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs中過(guò)表達(dá)Pin1導(dǎo)致p-pRb的蛋白水平顯著下降，同時(shí)VSMCs衰老程度降低。筆者還發(fā)現(xiàn)，相比正常VSMCs，動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs中細(xì)胞周期蛋白B、D和E表達(dá)明顯下調(diào)，反之當(dāng)Pin1過(guò)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞周期蛋白B、D和E上調(diào)，表明Pin1可能通過(guò)調(diào)控cyclin通路參與調(diào)節(jié)VSMCs的衰老。然而，在VSMCs中細(xì)胞周期蛋白B、D和E的表達(dá)具體如何被Pin1調(diào)控仍然有待進(jìn)一步研究。本研究表明，Pin1可能通過(guò)影響p-pRb通路以及cyclin通路來(lái)調(diào)控VSMCs衰老，為研究Pin1和動(dòng)脈粥樣硬化之間的潛在機(jī)制提供了新的視角。

Pin1在細(xì)胞衰老的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。TOKO等［15］證實(shí)，缺失Pin1會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停止，促進(jìn)細(xì)胞衰老，同時(shí)Pin1過(guò)表達(dá)能促進(jìn)心祖細(xì)胞分化并抑制其衰老。WHEATON等［16］報(bào)道，晚期人成纖維細(xì)胞中Pin1表達(dá)水平受抑制，促進(jìn)細(xì)胞衰老，而Pin1異常高表達(dá)阻止了BTG2介導(dǎo)的細(xì)胞衰老。但是，Pin1在VSMCs衰老中的作用還沒(méi)有被證實(shí)。動(dòng)脈粥樣硬化股動(dòng)脈組織中Pin1表達(dá)水平的上調(diào)支持筆者關(guān)于Pin1促進(jìn)VSMCs衰老的假設(shè)。

為了探求Pin1抑制VSMCs衰老的機(jī)制，本課題組檢測(cè)了Pin1對(duì)一些介導(dǎo)細(xì)胞衰老的關(guān)鍵因子的影響。研究表明，pRb是Pin1作用的靶點(diǎn)［17］。Pin1通過(guò)改變pRb的親和力而改變了周期蛋白依賴(lài)性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）的活性。pRb在G0到G1/S的過(guò)渡階段逐漸被CDKs磷酸化?；贑DKs增強(qiáng)Pin1-pRb聯(lián)系的證據(jù)，Pin1對(duì)于pRb通過(guò)CDKs進(jìn)行磷酸化的完整過(guò)程是必需的［18］。CDKs和細(xì)胞周期蛋白在磷酸化過(guò)程中是主要參與者，而Pin1是協(xié)調(diào)這一過(guò)程的關(guān)鍵蛋白［17］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs中伴隨著Pin1表達(dá)的下調(diào)，pRb磷酸化水平均增高，細(xì)胞周期蛋白B、D和E的表達(dá)水平下降。在動(dòng)脈粥樣硬化的VSMCs中，過(guò)表達(dá)Pin1可抑制pRb磷酸化，細(xì)胞周期蛋白B、D和E的表達(dá)水平上升。所有的結(jié)果表明，Pin1通過(guò)活化pRb通路和cyclin通路來(lái)調(diào)節(jié)VSMCs衰老，并且在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。當(dāng)然，調(diào)控VSMCs衰老的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的具體作用機(jī)制將是一個(gè)值得進(jìn)一步探索的新研究方向。

綜上所述，VSMCs的衰老或許對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的形成與發(fā)展有重要影響。因此，清晰地闡明VSMCs的衰老在動(dòng)脈粥樣硬化中的具體作用機(jī)制很重要。當(dāng)前研究結(jié)果表明，Pin1是VSMCs衰老調(diào)節(jié)機(jī)制中的關(guān)鍵因子，不僅拓寬了我們對(duì)于Pin1促進(jìn)VSMCs衰老的認(rèn)識(shí)，也為探索其具體分子機(jī)制提供了新的視角。因此，以Pin1為靶點(diǎn)的干預(yù)治療或許是緩解與VSMCs衰老有緊密關(guān)聯(lián)的動(dòng)脈粥樣硬化的新途徑。