血清外泌體miRNA-193b診斷阿爾茨海默病的價(jià)值

劉辰庚 楊婷婷 王培昌

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科（北京100053）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是老年人中最常見(jiàn)的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病。其病理改變主要表現(xiàn)為腦內(nèi)細(xì)胞外β淀粉樣蛋白（Aβ）和細(xì)胞內(nèi)磷酸化tau蛋白的大量沉積。輕度認(rèn)知障礙（mild cognitive impairment，MCI）被認(rèn)為是AD發(fā)病的前驅(qū)階段，主要表現(xiàn)為記憶力、注意力、語(yǔ)言和視空間等認(rèn)知功能不同程度的輕度下降。主觀認(rèn)知障礙（subjective cognitive decline，SCD）被認(rèn)為是AD的臨床前期階段，表現(xiàn)為患者主訴記憶力下降，而認(rèn)知評(píng)估卻表現(xiàn)為正常水平。癡呆期（dementia of Alzheimer′s type，DAT）是阿爾茨海默病晚期階段，表現(xiàn)為智力嚴(yán)重衰退，嚴(yán)重影響患者日常生活能力，對(duì)家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)［1］。因此，探索AD發(fā)病前期階段（前驅(qū)期和臨床前期）大腦生物標(biāo)志物改變將有助于對(duì)其進(jìn)行早期干預(yù)、早期治療，從而延緩病情的進(jìn)展［2］。

本實(shí)驗(yàn)室前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明miR-193b能通過(guò)與APP mRNA的3′-UTR結(jié)合使其降解從而抑制APP的蛋白表達(dá)，同時(shí)Aβ42能降低miR-193b的表達(dá)［3］。之后提取MCI和DAT患者CSF和血清的外泌體并檢測(cè)其中miR-193b的含量，發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)miR-193b在MCI患者的血清中較對(duì)照組顯著降低，且DAT患者血清外泌體內(nèi)miR-193b低于MCI患者。血清外泌體miR-193b可能為AD，特別是早期診斷AD的標(biāo)志物［4］。但是目前本課題組進(jìn)行的MCI和DAT患者血清外泌體miR-193b檢測(cè)尚屬小樣本研究，而且沒(méi)有納入SCD患者，因此本研究旨在通過(guò)大樣本檢測(cè)SCD、MCI、DAT患者血清外泌體miR193b的表達(dá)水平，進(jìn)一步探索血清外泌體miR193b作為AD的早期診斷標(biāo)志物的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料隨機(jī)選取2015年9月至2016年8月就診于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院SCD患者30例，其中男11例，女19例，平均年齡（61.66±5.43）歲。MCI患者69例，其中男30例，女39例，平均年齡（66.14±7.61）歲。DAT患者73例，其中男30例，女43例，平均年齡（74.12±8.19）歲。SCD患者診斷符合pre-MCI之主觀認(rèn)知障礙研究標(biāo)準(zhǔn)［5］。MCI和DAT疾病診斷符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院國(guó)立老化研究所和阿爾茨海默病協(xié)會(huì)于2011年4月聯(lián)合發(fā)布，并經(jīng)我國(guó)神經(jīng)內(nèi)科學(xué)會(huì)推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。另選同期性別和年齡基本一致的非癡呆對(duì)照人群75例（健康對(duì)照組），其中男36例，女39例，平均年齡（67.34±6.56）歲，該組人群基本健康，無(wú)腦梗死、腦出血、冠心病、腦外傷等病史；受試者或其家屬均簽署書面知情同意書，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)立項(xiàng)。

1.2主要儀器及試劑日立HT7700透射電子顯微鏡（日本日立高新技術(shù)公司）羅氏480定量PCR系統(tǒng)（德國(guó)Roche公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple公司）；Total exosome isolation reagent（from serum）試劑盒（Invitrogen）；血清miRNA提取分離試劑盒（天根生化科技有限公司）；miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）；miRNA熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green Ι染料法）（上海生工生物有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；抗Alix、CD63單克隆抗體（美國(guó)SBI公司）。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集受試者于空腹12 h后用促凝管采集外周靜脈血5～10 mL，勿顛倒混勻；室溫靜置30 min后，4℃、4 000 r/min離心10 min，取上層淡黃色血清，于冰上分裝成500 μL于1.5 mL EP管后置于-80℃冰箱備用。以上過(guò)程保證在2～3 h完成。

1.3.2血清外泌體的提取按照invitrogen公司total exosome isolation（from serum）外泌體提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.3透射電鏡鑒定血清外泌體形態(tài)取15～20 μL外泌體樣品懸液滴于帕拉膠上，并覆蓋銅網(wǎng)，室溫靜置5 min。用濾紙從側(cè)面吸去多余的液體，滴加20 g/L的磷鎢酸，室溫復(fù)染5 min。在65℃白熾燈下烤15 min。透射電鏡下觀察、拍照。

1.3.4Westrn blot檢測(cè)外泌體標(biāo)記蛋白將提取的外泌體總蛋白及血細(xì)胞蛋白經(jīng)BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，12%SDS-PAGE膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，漂洗5 min，加入按1∶1 000比例稀釋的兔抗人CD63、Alix單克隆抗體，室溫孵育1.5 h后4℃過(guò)夜。二抗室溫避光孵育120 min，均勻滴上ECL超敏化學(xué)發(fā)光液，進(jìn)行曝光拍照。

1.3.5血清外泌體內(nèi)miR-193b的提取及測(cè)定PCR反應(yīng)檢測(cè)血清中miR-193b水平：測(cè)量以試劑盒法提取外泌體總miRNA，測(cè)定濃度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中含2×miRNA RT Solution mix 10 μ L，miRNA RT Enzyme mix 2 μL，micro RNA100 ng。20 μL PCR反應(yīng)體系中含2×miRNA qPCR master mix10 μL，Template DNA 2 μL，相應(yīng)上、下游引物各 0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1，以U6 sn RNA為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法［7］計(jì)算并統(tǒng)計(jì)miR-193b組間表達(dá)的差異。

表1 PCR上游引物序列Tab.1 The sequence of PCR forward primers

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用2-△△Ct法計(jì)算miR-193b的相對(duì)表達(dá)量，使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用MedCalc software、GraphPad Prism軟件進(jìn)行作圖。應(yīng)用K-S檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；不同組之間miRNA的表達(dá)差異采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析采用分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)利用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）及曲線下面積（the area under the ROC curve，AUC）來(lái)評(píng)價(jià)miR-193b對(duì)AD的早期診斷價(jià)值，曲線下面積的比較采用Z檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血清中外泌體的分離鑒定首先，應(yīng)用納米粒子跟蹤分析（NTA）觀察外泌體樣品粒徑分布及顆粒濃度。如圖1A所示，顆粒直徑呈單峰正態(tài)分布曲線，顆粒主要分布于30～200 nm之間。樣品中顆粒分散均一。透射電鏡鑒定外泌體形態(tài)，電鏡內(nèi)可見(jiàn)直徑約為100 nm，圓形具有脂質(zhì)雙層膜囊狀的顆粒見(jiàn)圖1B。蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)外泌體標(biāo)志性蛋白分子的表達(dá)情況，表明提取的外泌體均表達(dá)Alix，CD63標(biāo)志性蛋白分子見(jiàn)圖1C；以上結(jié)果表明，樣品具有已報(bào)道的外泌體的特性。純化的樣品中含有大量外泌體顆粒。

2.2各組血清外泌體miR-193b表達(dá)水平變化

健康對(duì)照組、SCD、MCI及DAT患者4組血清外泌體miR-193b的表達(dá)水平如圖2A所示。4組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SCD、MCI和DAT患者血清外泌體內(nèi)miR-193b水平均低于對(duì)照組，且DAT組低于MCI組，MCI組低于SCD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3血清外泌體miR-193b對(duì)SCD的診斷價(jià)值檢測(cè)血清外泌體miR-193b用于診斷SCD時(shí)，AUC為0.947（95%CI：0.886 ～ 0.981），具有一定診斷價(jià)值。其診斷臨界值為1.83時(shí)，特異度為94.7%，靈敏度為83.3%。見(jiàn)圖2B。

圖1 外泌體的分離鑒定結(jié)果Fig.1 Isolation and identification results of exosomes

圖2 血清外泌體miR-193b在阿爾茨海默病患者中的檢測(cè)分析Fig.2 Detection and analysis of serum exosome miR-193b in patients with Alzheimer′s disease

3 討論

近年來(lái)利用各種生物標(biāo)志物來(lái)探測(cè)腦內(nèi)AD相關(guān)的病理及特征性改變，使得AD的診斷階段不斷提前，2014年主觀認(rèn)知下降概念啟動(dòng)組（subjective cognitive decline initiative，SCD-Ⅰ）提出的AD臨床前期的SCD概念框架，特別提出伴有ApoE ε4等位基因、AD病理相關(guān)的生物標(biāo)志物陽(yáng)性等條件可以增加其作為AD臨床前期的特異性［5］。因此，繼續(xù)深入研究AD相關(guān)診斷標(biāo)志物，有助于臨床診斷極早期AD，為AD的早期干預(yù)及治療提供更寬的時(shí)間窗。

研究發(fā)現(xiàn)miR在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。HEBERT等［8］發(fā)現(xiàn)，在早期AD患者皮質(zhì)中miR-107的表達(dá)顯著下降，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，在AD的發(fā)展過(guò)程中，當(dāng)miR-107表達(dá)降低時(shí)，BACE1蛋白水平增加，所以HEBERT等［8］推論miR-107可能通過(guò)調(diào)節(jié)BACE1基因的表達(dá)從而加速AD的進(jìn)展。KHOO等［9］對(duì)AD患者及對(duì)照的大腦皮質(zhì)區(qū)進(jìn)行miRNA分析，檢測(cè)到13種miRNA在AD腦內(nèi)的表達(dá)顯著降低，數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)7種miRNA的靶基因可能參與了AD病程，如miR-9、miR-15a、miR-19b和miR-29b-l均在BACE1基因的3′UTR 存在相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)；而 let-7、miR-15a、miR-101和miR-106b在APP基因的3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。雖然大多數(shù)miRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，但越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA也存在于細(xì)胞外的體液中，如血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液等［10-12］，特別是外周血miR對(duì)疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè)具有較大的潛在價(jià)值。MiRNA在細(xì)胞外的存在形式主要有3種：包裹于外泌體等膜囊泡中、與高密度脂蛋白結(jié)合以及與AGO2蛋白結(jié)合，這三種形式可避免細(xì)胞外miRNA被內(nèi)源性核糖核酸酶降解，保證其穩(wěn)定性［13-15］。而外泌體miRNA被認(rèn)為是在分泌細(xì)胞的支配下主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)特定的miR，雖來(lái)源于細(xì)胞，卻與來(lái)源細(xì)胞存在差異，并且其表達(dá)水平可隨生理?xiàng)l件的不同而改變，更能真實(shí)體現(xiàn)疾病的狀態(tài)，近年來(lái)頗受關(guān)注，逐漸成為了研究熱點(diǎn)。

本研究選擇了血清外泌體作為miRNA的來(lái)源，納入就診于本院的認(rèn)知障礙患者212例。通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外泌體中穩(wěn)定表達(dá)CD 63和Alix標(biāo)志性蛋白分子，并通過(guò)電鏡觀察證實(shí)了提取物為血清來(lái)源的外泌體，與文獻(xiàn)報(bào)道的類似。以純化的外泌體提取總RNA，通過(guò)qRT-PCR分別檢測(cè)認(rèn)知障礙患者和健康體檢人外泌體miR-193b水平，結(jié)果顯示，SCD、MCI和DAT患者血清外泌體內(nèi)miR-193b水平均低于健康對(duì)照組，且DAT組低于MCI組，MCI組低于SCD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。診斷試驗(yàn)提示血清外泌體miR-193b對(duì)SCD具有一定的診斷價(jià)值。此結(jié)果表明血清外泌體miR-193b可能成為AD早期診斷的有效檢測(cè)手段，具有一定的推廣應(yīng)用前景。但本研究為單中心的臨床研究，其結(jié)果尚需大規(guī)模、多中心的臨床研究證實(shí)，從而進(jìn)一步探索血清外泌體miR-193b作為AD早期診斷標(biāo)志物的意義。