黃連素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠血小板減少模型的保護(hù)作用

董亮 王淼 許華 王兵 王勇強(qiáng)

1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院（天津 300070）；2天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（天津 300193）；3天津市第一中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科天津市急救醫(yī)學(xué)研究所（天津 300192）

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為革蘭陰性菌細(xì)胞壁特有的組成成分，覆蓋于細(xì)胞壁的最外層，是一種常見的病原相關(guān)分子模式識(shí)別配體［1］。LPS被細(xì)菌釋放入血后可與機(jī)體相應(yīng)細(xì)胞上的受體結(jié)合誘發(fā)炎癥反應(yīng)，在膿毒癥發(fā)病過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。血小板減少（thrombocytopenia，TCP）是膿毒癥常見的并發(fā)癥，研究表明血小板減少程度與膿毒癥患者預(yù)后相關(guān)，膿毒癥并發(fā)TCP是預(yù)后不良的重要標(biāo)志［2］。因此，有效地緩解膿毒癥并發(fā)TCP患者的血小板減少程度對(duì)此類患者的預(yù)后有很大的幫助。黃連素又稱小檗堿（berberine，BBR），是一種從祖國傳統(tǒng)中藥黃連、黃柏等中藥植物中提取出來的生物堿［3］。研究報(bào)道顯示其具有較突出的抗炎作用，且能夠在一定程度上抑制血小板聚集及LPS引起的炎癥反應(yīng)，然而其對(duì)膿毒癥相關(guān)性血小板減少的作用尚未見報(bào)道［4-5］。本研究擬用單次腹腔注射LPS法制備小鼠TCP模型，并隨機(jī)分組分別給予不同劑量的黃連素處理，觀察黃連素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠TCP模型是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠100只，8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，證書：SCXK（京）2014-0004，于（25±2）℃，濕度45%～55%，每日光照8 h條件下飼養(yǎng)，期間自由飲水、進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)之前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2主要試劑脂多糖（LPS）、黃連素（BBR）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA·2Na）（北京索萊寶科技有限公司），TNF-α ELISA試劑盒、IL1-β ELISA試劑盒、IL18 ELISA試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司），小鼠CD41抗體、辣根過氧化物標(biāo)記的二抗（BD Biosciences），蘇木素染液（佰思諾（天津）生物科技有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥將100只小鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組（C組）、LPS模型組（LPS組）、LPS+低劑量BBR組（L組）、LPS+中劑量BBR組（M組）、LPS+高劑量BBR組（H組），每組20只。其中治療組給予不同劑量黃連素灌胃（低劑量BBR組給予5 mg/kg BBR，中劑量BBR組給予25 mg/kg BBR，高劑量給予50 mg/kg BBR），每天1次，連續(xù)3 d；第3天灌胃后3 h，LPS組及BBR干預(yù)組根據(jù)體重單次腹腔注射終濃度為25 mg/kg的LPS，以制備小鼠血小板減少模型，空白組根據(jù)體重給予腹腔注射適當(dāng)?shù)纳睇}水。

1.4小鼠一般狀況及生存率的觀察在LPS注射后觀察各組小鼠的飲食、排便等一般狀況及72 h內(nèi)的死亡情況。

1.5小鼠外周血血小板參數(shù)及炎癥因子的測定分別于LPS注射后0、2、6、24 h，于小鼠目內(nèi)眥采血30 μL，EDTA抗凝后全血細(xì)胞分析儀測血小板計(jì)數(shù)（PLT）、血小板壓積（PCT）、血小板寬度（PDW）和平均血小板體積（MPV）；分別于LPS注射后0、2、6、24 h，于小鼠目內(nèi)眥采血300 μL，取上清，用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β和IL-18的表達(dá)情況。

1.6免疫組化檢測各組小鼠肺組織血小板滯留情況于LPS注射24 h取血后，頸椎脫臼處死小鼠，取肺臟組織，10%福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋并切片，脫蠟、抗原修復(fù)后加3%過氧化氫溶液室溫避光孵育25 min，PBS脫色洗滌3次，BSA封閉30 min，小鼠CD41抗體，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，二抗室溫孵育50 min，PBS洗滌3次并用DAB顯色，蘇木素復(fù)染、沖洗，脫水封片，觀察并分析結(jié)果。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分別應(yīng)用SAS軟件、SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的多次測量資料采用重復(fù)測量方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法比較組間生存率，多組間比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性檢驗(yàn)采用LSD檢驗(yàn)方法，方差不齊時(shí)采用Dunnett′s T3檢驗(yàn)方法。計(jì)量資料以表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1BBR對(duì)LPS誘導(dǎo)TCP小鼠一般狀況的影響在LPS注射24 h時(shí)觀察各組小鼠的一般狀況，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠活動(dòng)量正常，對(duì)外界刺激反應(yīng)迅速，毛發(fā)光澤，飲食、排便情況正常，眼部無充血、粘連、潰爛等情況。LPS處理組小鼠表現(xiàn)出無活動(dòng)，對(duì)外界刺激反應(yīng)力遲鈍或無反應(yīng)，身體卷軀，聚集成堆，寒戰(zhàn)，嗜睡，毛發(fā)暗淡、豎立，眼結(jié)膜充血、分泌物增多甚至粘連、潰爛，飲食量下降，大便稀溏。BBR干預(yù)組小鼠表現(xiàn)為活動(dòng)量減少，對(duì)外界刺激反應(yīng)力減弱或遲鈍，毛發(fā)雖暗淡，但眼結(jié)膜無充血及分泌物，飲食量亦下降，但大便成形偏軟或干燥，整體表現(xiàn)較LPS組有所改善。

2.2BBR對(duì)LPS誘導(dǎo)TCP小鼠生存率的影響通過觀察各組小鼠72 h內(nèi)的生存率，結(jié)果顯示C組、M組、H組72 h生存率為100%；LPS組72 h內(nèi)生存率為60%，48 h內(nèi)生存率為70%，24 h內(nèi)生存率為90%；L組72 h內(nèi)生存率為80%，48 h內(nèi)生存率為80%，24 h內(nèi)生存率為100%。提示，M組、H組生存率高于LPS組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.71，P=0.03）（圖1）。

圖1 BBR對(duì)LPS誘導(dǎo)TCP小鼠生存率的影響Fig.1 Effect of BBR on the survival rate of LPS-induced TCP mice

2.3BBR對(duì)LPS誘導(dǎo)TCP小鼠外周血血小板參數(shù)的影響分別收集LPS注射后0、2、6和24 h的外周血并檢測血小板參數(shù)，結(jié)果顯示，除C組外，其余各組從0～24 h，外周血中PLT和PCT均逐漸下降，且與C組相比，LPS組、L組、M組、H組在2、6、24 h的PLT和PCT均明顯降低，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.001）。其中PLT結(jié)果分析顯示，與LPS組相比，M組、H組在2、6、24 h的PLT高于LPS組（P＜0.001）。L組在2 h的PLT高于LPS組（P=0.002），L組在6、24 h的PLT與LPS組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。L組在2、6、24 h的PLT低于M組、H組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。H組在6 h的PLT高于M組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004），但在2、24 h的PLT兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2A）。PCT結(jié)果分析顯示，LPS組僅在24 h的PCT顯著低于M組和H組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.047，P=0.02）；其余時(shí)間點(diǎn)，L組、M組、H組的PCT與LPS組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖2B）。PDW和MPV檢測結(jié)果顯示，從2、6到24 h，除C組外，其余各組的PDW和MPV均逐漸升高，且與C組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.001）。但BBR干預(yù)組與LPS組組間及BBR干預(yù)組組間PDW值相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2C）。與C組相比，LPS組、L組在2、6、24 h的MPV均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001）；而M組與H組在6 h和24 h時(shí)的MPV值與C組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但BBR干預(yù)組與LPS組組間及BBR干預(yù)組組間MPV值相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2D）。

2.4BBR對(duì)LPS誘導(dǎo)TCP小鼠外周血炎癥因子表達(dá)的影響通過對(duì)LPS注射后各時(shí)間點(diǎn)小鼠外周血血清中TNF-α、IL-1β和IL-18表達(dá)情況的檢測，結(jié)果顯示：在LPS注射后，除C組外，其余各組的TNF-α、IL-1β和IL-18表達(dá)量均隨觀察時(shí)間的延長而降低，且與C組相比，其余各組的TNF-α、IL-1β和IL-18水平在LPS注射后2、6、24 h均顯著增高（P＜0.001，其中H組在24 h的IL-18水平較C組高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；與LPS組相比，M組、H組在2、6、24 h時(shí)各因子水平明顯低于LPS組（P＜0.05或P＜0.01），L組在2 h時(shí)各因子水平明顯低于LPS組（P＜0.05或P＜0.01），在6 h時(shí)，TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平低于LPS組（P＜0.05），在24 h時(shí)，各因子水平與LPS組相比均無顯著差異（P＞0.05）（圖3）；在LPS注射后2、6、24 h，L組的各因子水平均顯著高于M組與H組（P＜0.05或P＜0.01），而M組的TNF-α的表達(dá)水平在6 h和24 h時(shí)高于H組（P＜0.001）（圖3A），其IL-1β的表達(dá)水平在2 h和6 h時(shí)顯著高于H組（P＜0.05）（圖3B），而IL-18的表達(dá)水平在2 h、6 h、24 h均顯著高于H組（P＜0.05或P＜0.01）（圖3C）。

圖2 全血細(xì)胞分析儀檢測BBR對(duì)LPS誘導(dǎo)TCP小鼠外周血血小板參數(shù)的影響Fig.2 The effect of BBR on the peripheral blood platelet parameters of TCP mice induced by LPS by whole blood cell analyzer

圖3 ELISA試劑盒檢測BBR對(duì)LPS誘導(dǎo)TCP小鼠外周血炎癥因子表達(dá)的影響Fig.3 ELISA kit for detecting the effect of BBR on the expression of inflammatory cytokines in peripheral blood of TCP mice induced by LPS

2.5BBR對(duì)LPS誘導(dǎo)TCP小鼠肺臟血小板滯留的影響通過收集小鼠肺臟組織并對(duì)其進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果顯示：模型組小鼠肺臟組織中CD41的IOD值均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），BBR干預(yù)組小鼠肺臟組織中CD41的IOD值均顯著低于LPS組（P＜0.01），L組IOD值高于M組、H組（P＜0.01）；M組、H組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）（圖4）。

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測BBR對(duì)LPS誘導(dǎo)TCP小鼠肺臟血小板滯留的影響Fig.4 Immunohistochemical method for detecting the effect of BBR on LPS-induced lung platelet retention in TCP mice

3 討論

膿毒癥是由感染引起的反應(yīng)失調(diào)而出現(xiàn)致死性的器官功能障礙，是危重癥患者死亡的主要原因之一［6］。血小板減少則是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥，研究表明血小板減少程度與膿毒癥患者的預(yù)后不良具有相關(guān)性［7］。膿毒癥伴血小板減少患者的病情通常較不伴血小板減少的患者更重，雖然隨著醫(yī)療科技及高效綜合管理的不斷更新，膿毒癥患者的病死率已有所改善，但膿毒癥相關(guān)性血小板減少的發(fā)病機(jī)制仍未闡明，人們對(duì)膿毒癥相關(guān)性血小板減少患者的治療仍需進(jìn)一步的研究和改進(jìn)。

黃連素作為傳統(tǒng)中藥，由來已久，古書記載其不僅具有清熱解痛、除胎毒、防斑疹的作用，還具有清滌血熱，去心之惡血之療效。近年來研究［8］表明，黃連素具有一定的抗內(nèi)毒素作用，能抑制LPS的促凝血作用，但黃連素對(duì)LPS誘發(fā)的血小板減少尚未見報(bào)道。為探究黃連素是否對(duì)LPS誘發(fā)的血小板減少有影響，本研究采用了黃連素預(yù)處理小鼠及野生小鼠用LPS單次腹腔注射法誘導(dǎo)小鼠TCP模型，觀察記錄各組小鼠的一般狀況及72 h內(nèi)的生存率并檢測LPS注射后小鼠外周血中血小板各項(xiàng)參數(shù)和炎癥因子的變化情況，以及收集小鼠肺臟組織檢測肺臟內(nèi)血小板的滯留情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃連素能夠在一定程度上緩解LPS給小鼠帶來的傷害，能夠有效地改善LPS刺激后小鼠的生存率。血小板參數(shù)檢測結(jié)果提示黃連素能夠抑制LPS誘導(dǎo)的血小板減少，并且黃連素的這一作用呈劑量依賴性。除此之外，黃連素還可抑制LPS誘發(fā)的外周血中TNF-α、IL-1β、IL-18水平的升高，在一定程度上緩解機(jī)體的炎癥反應(yīng)。肺組織免疫組化結(jié)果提示黃連素能夠減少LPS誘發(fā)的血小板在肺臟中的滯留，并且還能夠在一定程度上改善LPS引起的肺損傷。這些觀察、檢測結(jié)果均表明黃連素對(duì)LPS誘發(fā)的小鼠TCP模型具有一定的保護(hù)作用，黃連素可通過抑制LPS引起的血小板減少、炎癥反應(yīng)以及血小板在肺臟中的滯留來減輕LPS對(duì)小鼠機(jī)體帶來的損傷，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。